《日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验》(WS/T 630-2018)标准解读

张世清, 章乐生, 汪峰峰, 汪天平

血吸虫病是世界卫生组织确定的六大重点热带病之一，也是严重威胁我国人民身体健康和阻碍经济社会发展的重大传染病。 间接红细胞凝集试验(以下简称“IHA”)作为一种经典的血吸虫病免疫学诊断方法，较早应用于我国血吸虫病流行区人群查病工作[1，2]。 凭借其较高的敏感性以及技术成熟、操作便捷、价格低廉等特点[3-5]，在安徽、湖南、湖北、江西、云南、浙江等血吸虫病流行省份，IHA 方法普遍应用于疫区人群血吸虫病筛查，目前已占全国筛查人群的70%以上，为当前我国血吸虫病现场人群查病的主要方法[6]。 但是，IHA 方法在现场应用时也存在一定的不足之处。 因其方法为半定量，且对结果判断需肉眼观察，存在一定的主观性[6]。原卫生部于2006 年曾发布《血吸虫病诊断标准》(WS261-2006)，该标准规定了血吸虫病的诊断依据、诊断原则、诊断标准和鉴别诊断，但目前尚无日本血吸虫抗体检测(间接红细胞凝集试验)技术规范文献。 作为目前我国血吸虫病主要诊断方法，缺乏统一规范的操作规程和技术标准，不同地区、不同技术人员开展血吸虫病检测时，结果存在一定差异，亦影响了检测结果的质量、可信度和可比性。 因此，迫切需要建立一套标准的操作规程和判断方法，以确保结果的可比性和准确性，同时对我国当前血吸虫病诊断网络实验室建设也具有指导作用。 本标准的制定旨在通过规范日本血吸虫抗体检测(间接红细胞凝集试验)操作方法、结果判定、应用范围以及注意事项等，提高检测结果的准确性和可比性，减小漏判和误判，以适应临床诊断和现场防治工作的需求。

1 标准编制过程与方法

本标准是受原国家卫生与计划生育委员会政策法规司委托，安徽省血吸虫病防治研究所、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、浙江省医学科学院寄生虫病研究所、江苏省血吸虫病防治研究所、江西省寄生虫病防治研究所等单位有关专家共同编制。 在编制过程中先后召开2 次专家研讨会，并函请全国从事寄生虫病预防控制、临床、教学、科研等单位的21 位专家征求意见。 21 位专家来自安徽、江苏、湖南、湖北、江西、云南、四川、上海、广东等省份，涵括了目前我国血吸虫病重点流行省份。 本标准从起草至形成标准报批稿过程中，起草组对收到的102 条专家反馈意见进行逐项研究讨论，其中采纳38 条，部分采纳15 条，未采纳49 条。 在征集整理函审专家的意见过程中，函审专家对本标准中采集样本的放置时间和血清分离相对离心力的确定、试剂盒从冷藏储存环境取出后平衡时间、致敏红细胞悬液配制后放置不同时间对于结果的影响、观察结果的最佳控制时间等4 个关键指标关注点比较集中，本标准编制专家工作组对4 个指标分别进行了现场验证与评价，根据现场验证结果，讨论并修订该指标的相关参数。 标准编制过程中采用查询文献资料、现场调研及验证等方式，并广泛征求疾病预防控制中心、寄生虫病防治研究所以及高等院校等各领域专家的意见，确保标准的实用性和科学性。 本标准的编制参考了《血吸虫病诊断标准》(WS 261-2006)、《血吸虫病控制和消除》(GB 15976-2015)、《血吸虫病防治手册》(第三版)等文献，遵循《卫生标准管理办法》相关规定并按照《标准化工作导则》(GBT 1.1-2009)的体例和写作方式进行编制，最终形成了《日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验》(WS/T 630-2018)卫生行业推荐标准，并由中华人民共和国国家卫生健康委员会于2018 年9 月26 日发布，2019 年4 月1 日实施。

2 标准的正文内容

本标准为卫生行业推荐性标准。 正文由六个部分组成，包括标准适用范围、术语和定义、所需仪器设备、试剂材料、检测步骤和结果判定依据。 另外，标准附有三个资料性附录，详细介绍了标准中涉及到的主要试剂材料的制备方法、操作程序以及结果判定的标准。 本标准的制定，充分考虑了我国各级疾病预防控制机构和医疗机构实验室的设施设备，适合我国日本血吸虫抗体检测工作的实际需要，为我国血吸虫病防治和临床辅助诊断提供可靠的技术保障。 其主要内容包括:

2.1 范围 本标准规定了间接红细胞凝集试验检测日本血吸虫抗体的技术规范，适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对日本血吸虫抗体的检测。

2.2 术语和定义 本标准明确了血吸虫病、间接红细胞凝集试验、可溶性虫卵抗原的定义，并进行了科学解释。

2.2.1 血吸虫病 由血吸虫寄生于人和其他哺乳动物所引起的疾病，在我国特指日本血吸虫病。

2.2.2 间接红细胞凝集试验 将抗原包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体结合，通过抗体桥联，出现肉眼可见的凝集现象，以检测样本中的相应抗体。 最常用的红细胞为健康人“O”型红细胞。

2.2.3 可溶性虫卵抗原 血吸虫虫卵经匀浆和超声破碎等处理后离心收集的上清液，含蛋白质、糖蛋白、多糖等多种成分复合物。

2.3 仪器设备 本标准对采用间接红细胞凝集试验检测日本血吸虫抗体必要的仪器设备及技术参数提出了要求，其必要的仪器设备应包括台式低速离心机、平板微量振荡器、电热恒温水浴箱、微量移液器等，也为进一步规范血吸虫病诊断网络实验室建设提供了参考依据。 其中台式低速离心机技术参数要求最高转速≥2 500 r/min，或最大相对离心力≥800 g；平板微量振荡器技术参数要求最高振动频率2 800 r/min，最大振幅6 mm；电热恒温水浴箱技术参数要求控温范围室温+5 ℃～99.9 ℃，温度分辨率/波动度0.1 ℃/±0.5 ℃；微量移液器技术参数要求量程范围10～100 μL，增量1 μL；量程范围100 ～1 000 μL，增量5 μL。

2.4 试剂材料 本标准明确规定了“日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验”主要试剂材料及技术参数。 试剂材料中除冻干致敏红细胞以外，强调应同时配置阳性对照血清和阴性对照血清，以确保试验结果的可靠性。 其中冻干致敏红细胞的主要组成成分为日本血吸虫可溶性虫卵抗原、健康人“O”型红细胞和蔗糖，阳性对照血清的来源为感染日本血吸虫的兔混合血清，阴性对照血清的来源为正常兔混合血清。 此外，也是首次明确要求将pH7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)作为稀释液。 为保证试验结果的准确性，本标准推荐使用“V”型微孔有机玻璃血凝板作为血凝反应板。

2.5 检测步骤 本标准规定了“日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验”的操作规程及技术规范要求。 此外，本标准通过现场验证，进一步明确了检测过程中涉及的采集样本的放置时间、试剂盒从冷藏储存环境取出后平衡时间、致敏红细胞悬液配制后放置时间、观察结果的最佳控制时间等关键指标要求。

2.5.1 样本准备 明确检测样本为血清，可通过采集末梢血或静脉血的方式，室温下放置至血块收缩后或离心分离出血清。

2.5.2 样本检测 在广泛征集血防区相关省、市、县等各级血防机构专家意见的基础上，对“日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验”操作步骤进行了明确规定，统一了操作规程。 在待检样本准备好之后，样本检测过程依次按照样本编号、溶解阳性对照及阴性对照血清、滴加稀释液、倍比稀释待检血清以及阳性和阴性对照血清、稀释冻干致敏红细胞、血清稀释孔滴加致敏红细胞悬液、观察结果等操作步骤。 本标准在征集专家意见的基础上，对血清样本稀释、致敏红细胞悬液加入方法以及观察结果的条件进行了统一。

2.6 结果判定 本标准规定了结果判定标准，以效价≥1 ∶10 作为阳性判断标准，规定只有在阴性对照血清不出现凝集现象，阳性对照血清出现凝集现象，检测结果才视为有效。

3 标准的附录内容

本标准有3 个资料性附录，分别对主要试剂材料的制备方法、各个操作流程的注意事项以及结果判定标准进行了详尽的描述。

附录A 为主要试剂材料制备方法。 本附录对冻干致敏红细胞、阳性对照血清、阴性对照血清以及稀释液等主要试剂材料的制备方法进行了较为详细的描述。 为保证主要试剂材料的质量，本标准对其技术参数进行了明确规定，其中冻干致敏红细胞要求外观为褐色或淡红色疏松体，阳性对照血清检测效价不低于1 ∶640；阴性对照血清检测效价不高于1 ∶5；稀释液为pH 7.2 磷酸盐缓冲液。

附录B 为操作程序。 本附录对“日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验”操作各个流程的注意事项进行了详尽的说明，包括采样及样本保存、试剂准备、加样、反应条件、观察结果等。 如血样采集后要求在4 h 内进行血清分离，待检血清量不少于25 μL，如果采集样本不能及时检测应置于-20℃以下冷冻条件下进行长时间保存；检测试剂应放在室温条件下平衡30 min 以上再行使用；红细胞悬液使用前需充分混匀；结果观察应在10 min 内完成等，否则将影响检测结果的准确性。 尤其是本附录中依据操作流程首次制作了标准操作流程示意图，便于本标准的宣贯及现场推广应用。

附录C 为结果判定标准。 本附录对“日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验”阳性和阴性结果的判定方法和依据进行规定，对凝集反应的特征进行了描述，并根据反应强度的特点制作了不同反应强度模式图。

4 标准施行和宣贯重点

IHA 是迄今为止在我国血吸虫病流行区应用时间最长、使用范围最广、检测人数最多的免疫学诊断方法。 但各基层血吸虫病预防控制机构在实际应用过程中，依然存在诸多问题。 为了充分发挥该方法在我国消除血吸虫病过程中的作用，加快推进我国消除血吸虫病进程，应加强对本标准宣传贯彻的力度，进一步规范本标准的实施。 为此，在本标准的施行及宣贯工作中应重点把握以下几点:① 样本采集过程中，有的地区采用聚乙烯塑料管采集末梢(耳垂或手指)血，待血液凝固后离心分离血清，后用剪刀将凝固的血块部分剪去保留血清部分。 在此过程中，需注意剪刀在剪去凝固血块后，需用酒精棉球将剪刀残余血渍擦除并进行消毒，再用干棉球擦干后方可继续使用，避免出现交叉污染现象。 ② 本标准“试剂材料”中推荐使用96 孔“V”型有机玻璃板，并在附录部分特别强调有机玻璃板在使用后需及时清洗。 在操作过程中，使用96 孔“V”型有机玻璃板观察结果后，如不及时进行清洗，红细胞和血清中蛋白等物质易在孔底沉淀并牢固附着于孔底表面，再次使用有机板时，会对结果产生影响。 ③在实际操作过程中，应严格按照操作步骤示意图进行实验操作，不宜改动相关步骤。 为便于现场检验人员操作，本标准在附录B 中添加了操作步骤示意图，使得间接红细胞凝集试验方法简单化、条理化。 但在现场验证过程中，时常发现现场检验人员仍按照以前操作流程，没有完全按照本标准的操作步骤，如将“冻干致敏红细胞稀释”过程放在“待测样本稀释”过程之前。 血清样本尚未稀释，就将冻干致敏红细胞进行稀释，会导致红细胞悬液在后期出现红细胞沉淀于瓶底且不易混匀，在最后滴加红细胞悬液时出现红细胞浓度不均现象，进而影响检测结果及结果判断。

本标准从仪器设备、试剂材料、检测步骤、结果判断以及操作注意事项等方面作了详尽的介绍，以期指导检验人员在操作过程中能够做到操作的一致性，使结果更加准确可靠，并克服或减少本方法所存在的主观判断所带来的缺陷。 各地在实际工作过程中运用间接血凝方法检测血吸虫抗体所存在的相关细节不同，为此，在做好本标准宣贯的同时，应广泛开展本标准操作的技能培训，使各使用部门以及相关实验室检测人员，能够了解并掌握本标准相关内容和条款，熟练运用间接血凝方法检测血吸虫抗体。各级血吸虫病预防控制机构应将本检测方法作为血吸虫病诊断网络实验室考核评估的重要内容。