UPLC法同时测定市售菟丝子中5种化学成分的含量

唐冰雯,林秀莲,李华

(1.广州卫生职业技术学院，广东 广州 510450；2.广东药科大学，广东 广州 510006；3.广东省药品检验所，广东 广州 510663)

菟丝子收载于《中国药典》2015年版，为旋花科植物南方菟丝子(CwscwiaaustralisR.Br.)或菟丝子(CuscutachinensisLam.)干燥成熟种子，辛、甘，平，归肝、肾、脾经。可补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻，外用消风祛斑[1]。研究发现菟丝子主要药效成分除常见的黄酮类化合物外，还有酚酸类和木质素类等化合物[2-4]，具有多种功效如保肝、免疫调节、抗衰老、抗氧化、促性腺激素样等[5]。有文献报道利用高效液相色谱(HPLC)法对菟丝子中的黄酮类化合物进行质量控制[6-8]，而由于市售的菟丝子药材品种繁多，产地广泛，且存在生产和来源的差异，进而出现药材的质量差异从而影响其药效及临床的合理应用。在建立了菟丝子饮片指纹图谱及含菟丝子成分的补肾强身片的质量控制及物质基础研究等前期研究基础上[9-10]，为了进一步全面、快速、准确地控制菟丝子的质量，本试验选择黄酮类中的金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚及具备抗炎作用的酚酸类物质绿原酸，作为菟丝子的质量控制指标，并以此建立超高效液相色谱(UPLC)法同时测定这5类化学成分的含量，为进一步提高和完善菟丝子质量标准提供参考。

1 仪器与试药

岛津Nexera LC-30A超高效液相色谱仪，配有LC30-AD二元泵，SIL-30AC自动进样器，SPD-M30A PDA检测器，CTO-20AC柱温箱；KQ-300DE型超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(Sartorius CP224S及CP225D)。乙腈，色谱纯(美国Honeywell公司)；甲醇和甲酸，分析纯(广州化学试剂厂)。

紫云英苷对照品(含量：98.0%，批号：480104)，购于上海安谱实验科技股份有限公司；异槲皮苷对照品(含量：92.9%，批号：111809-201403)，山柰素对照品(含量：95.5%，批号：110861-201310)、金丝桃苷对照品(含量：94.3%，批号：111521-201507)、绿原酸对照品(含量：96.2%，批号：110753-201415)均购买于中国食品药品检定研究院。样品为来源于19个生产厂家的菟丝子药材共20批次，经广东省药品检验所中药室林锦峰主任鉴定均为旋花科植物南方菟丝子(CwscwiaaustralisR.Br.)或菟丝子(CuscutachinensisLam.)干燥成熟种子。药材样品覆盖全国9省(市)包括北京、安徽、河北、甘肃、浙江、青海、江苏、广西、四川等，详见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)作为流动相，梯度洗脱(程序为0～4 min，7%→9%A；8～11 min，13%A；11～18 min，13%→14%A；18～24 min，14%→30%A；24～30 min，30%→31%A)；柱温：35 ℃；分段检测波长(1～5 min，325 nm； 5～12 min，260 nm；12～30 min，360 nm)；体积流量：0.4 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取菟丝子粉末适量过二号筛，精密称定约1 g，置50 mL量瓶中，加入40 mL的80%甲醇，采用超声处理60 min(功率500 W，频率40 kHz)，放冷后用80%甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液，即可。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成混合对照贮备液(每1 mL含异槲皮苷180.60 μg、紫云英苷173.07 μg、金丝桃苷226.32 μg、山柰酚173.28 μg、绿原酸200.09 μg)。

2.3 色谱系统适用性试验 分别精密吸取“2.2.2”项下制成的混合对照溶液(含异槲皮苷22.57 mg·L-1、紫云英苷21.63 mg·L-1、金丝桃苷28.29 mg·L-1、山柰酚21.65 mg·L-1、绿原酸25.01 mg·L-1)和供试品溶液各2 μL，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，结果见图1。异槲皮苷、紫云英苷、金丝桃苷、山柰酚、绿原酸与相邻的色谱峰分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，理论板数以各成分色谱峰计算均在6 000以上。

A.混合对照溶液；B.样品 1-绿原酸(chlorogenic acid)；2-金丝桃苷(hyperoside)；3-异槲皮苷(isoquercitrin)；4-紫云英苷(astragalin)； 5-山柰素(kaempferol)图1 混合对照品系统适应性色谱图

2.4 线性与范围 精密量取“2.2”项下混合对照溶液适量，逐级稀释到不同质量浓度的混合对照溶液异槲皮苷(180.60、90.30、45.15、22.57、11.29、2.26、0.45 mg·L-1)；紫云英苷(173.07、86.53、43.27、21.62、10.87、2.16、0.43 mg·L-1)；金丝桃苷(226.32、113.16、56.58、28.29、14.14、2.83、0.56 mg·L-1)；山柰酚(173.28、86.62、43.31、21.65、10.83、2.16、0.43 mg·L-1)；绿原酸(200.09、100.05、50.02、25.01、12.51、2.50、0.50 mg·L-1)，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积A为纵坐标，质量浓度C(mg·L-1)为横坐标进行线性回归，结果见表2，5种成分峰面积与浓度的线性关系良好(r>0.999 9)

2.5 检测限与定量限 按照“2.1”项下色谱条件，通过稀释不同浓度的标准品得到5种成分的定量限(S/N为10)和检测限(S/N为3)，结果见表2。

表2 5种成分的回归方程和线性范围

2.6 精密度试验 取混合对照溶液(含异槲皮苷22.57 mg·L-1、紫云英苷21.63 mg·L-1、金丝桃苷28.29 mg·L-1、山柰酚21.65 mg·L-1、绿原酸25.01 mg·L-1)，按“2.1”项下的色谱条件连续进样5次，以峰面积为指标计算RSD(n=5)，考察方法的精密度。测定绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均峰面积分别为426 025、345 229、266 540、215 548、465 495，峰面积RSD分别为0.38%、0.79%、0.99%、1.46%、0.65%，说明该仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取批号160201的同一份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h测定，选用峰面积为指标计算RSD(n=6)，考察方法的稳定性。测定绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均峰面积分别为655 981、724 005、100 986、169 143、201 480、峰面积RSD分别为0.30%、0.36%、0.63%、0.22%、0.40%，表明供试品溶液在24 h内稳定.

2.8 重复性试验 取同一批号样品(批号：160201)，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，以峰面积为指标计算RSD(n=6)，考察方法的重复性。分别测定绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚的平均含量为1.9370、3.0113、0.4268、0.9163、0.4712 mg·g-1，峰面积RSD为1.85%、1.59%、1.18%、2.36%、2.64%，表明方法重复性良好。

2.9 加样回收试验 精密称取已知绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷及山柰酚含量的菟丝子样品(批号：160201)约0.5 g，共9份，于每3份中分别加入近似1∶0.5、1∶1、1∶1.5的各个对照品溶液，按照“2.2.1”项下制备供试品溶液，测定峰面积，计算回收率，结果见表3。5种化合物的平均回收率(n=9)分别为102.0%(RSD=1.56%)、99.0%(RSD=2.90%)、100.1%(RSD=3.19%)、100.2%(RSD=3.00%)、99.3%(RSD=4.25%)，说明该方法的准确度良好。

表3 回收率试验结果(n=9)

2.10 样品含量测定 分别精密吸取20批次供试品溶液2 μL，进样测定。选用外标法分别计算绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷和山柰酚的含量，结果见表4。比较20批次样品5种成分含量及总含量发现，大部分厂家生产的菟丝子质量一致性较好，也有部分批次样品5种成分含量及总含量较低，存在一定差异。

表4 5种成分含量测定结果(n≥3)

3 讨论

本文测定的菟丝子化学成分可分为黄酮类和酚酸两大类，其中金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷和山柰酚为黄酮类，绿原酸为酚酸类。通过考察不同比例的甲醇-水(40∶60、80∶60、100∶0)来寻找最佳提取溶剂，结果显示甲醇-水(80∶20)提取率最高，故采用甲醇-水(80∶20)作为提取溶剂。试验还考察了加热回流法和超声提取法两种不同提取方式，结果显示两种提取方法的提取结果相近，考虑到试验的简便性，选用超声提取的方法。同时还分别考察20、40、60、80 min的超声提取效果，结果表明60 min与80 min的超声提取率接近，为了缩短试验时间，采用超声提取60 min为宜。对于InertSustainSwiftTMC18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)、Agilent SB-C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、WatersACQUITYTMBEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)等3种不同厂家和不同粒径的色谱柱也进行了考察，结果表明以上3种色谱柱均可实现较好的分离样品，获得良好的峰形和分离度。此外，选用二极管阵列检测器来记录200～400 nm的紫外吸收光谱图，结果表明，绿原酸在325 nm处有较好的吸收，金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷和山柰酚均在360 nm处有较好的吸收，且为了基线更加平稳，选择分段波长检测：0～5 min，325 nm；5～12 min，260 nm；12～30 min，360 nm。

从各厂家批次样品含量分析结果来看，发现绿原酸含量在0.832 7～2.142 6 mg·g-1之间，金丝桃苷含量在2.282 5～4.287 6 mg·g-1之间，异槲皮苷含量在0.856～0.488 6 mg·g-1之间，紫云英苷含量在0.896 1～1.548 8 mg·g-1之间，山柰酚含量在0.032 6～0.786 3 mg·g-1。不同的厂家和生产批号的菟丝子饮片中5种化学成分的含量接近，但是仍出现了个别样品的酚酸及黄酮类物质含量偏低的情况。可能原因考虑为不同厂家的地域气候等因素及不同批号间饮片不同的生产时间和贮存条件的所带来的差异。

本试验系统考察了样品前处理方法和色谱条件对菟丝子中酚酸类和黄酮类成分含量测定方法的影响，并在此基础建立快速、简便、准确的UPLC法同时测定菟丝子中绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、和山柰酚5种成分的含量，并对该方法进行了系统的方法学验证。UPLC法灵敏度高、稳定性好，本试验所建立的含量测定方法适用于菟丝子药材的质量控制研究，为进一步提高和完善菟丝子质量标准提供参考。