基于离子交换色谱法检测结核治疗性DNA疫苗纯度的方法建立

孔雯雯，周飞燕，符美娟，杨丽菲，梁艳，吴雪琼，倪世明，黄明

(1.广州白云山拜迪生物医药有限公司，广东 广州 511495；2.中国人民解放军总医院第八医学中心结核病重点实验室，北京 100091)

结核病是由结核分枝杆菌引起的呼吸道传染病，属于重大传染病之一[1-2]。临床上应用最为广泛的结核疫苗为卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，其对新生儿及儿童结核性脑膜炎和粟粒性肺结核具有有效预防效果，但对成人结核病和结核分枝杆菌潜伏感染保护效果有限[3-9]。目前已有多种结核候选疫苗处于临床研究阶段，主要包括用于增强BCG免疫效力的蛋白亚单位疫苗、病毒载体疫苗和治疗性DNA疫苗，及代替BCG的重组BCG等[10-18]。结核治疗性DNA疫苗是采用基因重组技术构建，通过细菌发酵、裂解和纯化后制备的质粒DNA，为确保质粒的质量，质粒DNA疫苗的指导原则要求对DNA的纯度进行质量控制[19]。目前对DNA纯度的检测方法主要有琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱法[20-22]。琼脂糖凝胶电泳法操作简便但分辨率较低，高效液相色谱法可以更准确地检测DNA纯度。为了对生产制备的结核治疗性DNA疫苗进行有效质量控制，本文拟采用高效液相色谱法检测重组质粒DNA制剂的纯度。该法是通过阴离子交换色谱法对质粒DNA进行分离并在特定波长进行测定，采用面积归一化法计算目的质粒峰的百分比，从而建立结核治疗性DNA疫苗的纯度的检验方法，并对该方法进行验证，为结核治疗性DNA疫苗质量控制和质量标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 三羟甲基氨基甲烷(Tris Base，色谱纯)购自美国Merck公司；氯化钠(分析纯)和盐酸(分析纯)均购自广州化学试剂厂；氯化钠(药用级)购自河北华晨药业有限公司；磷酸氢二钠(药用级)、磷酸二氢钠(药用级)购自湖南九典制药有限公司；结核DNA疫苗成品(20170301、20170302、20170303)为广州白云山拜迪生物医药有限公司制备的样品；Agilent 1100 高效液相色谱仪(配有 G1315B DAD 检测器、 G1311A 四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱)和化学工作站(ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635])均购自美国安捷伦科技有限公司；Agilent 1260 高效液相色谱仪(配有G7117C DAD 检测器、 G7111A 四元梯度泵、G7129A 自动进样器、G7116A 柱温箱)和化学工作站(Openlab 2.1chemstation)均购自美国安捷伦科技有限公司；BS124S 型电子天平购自德国赛多利斯科学仪器有限公司；色谱柱 TSK-gel DNA-NPR(4.6 mm×75 mm,2.5 μm)购自日本Tosoh公司。

1.2 供试品溶液及PBS对照液的配制 用流动相A将20170301批、20170302批和20170303 批结核ag85ab DNA 疫苗成品分别稀释成 0.10 mg·mL-1的溶液，10 000 r·min-1离心后吸取上清，作为供试品 1、供试品 2和供试品 3备用。称取氯化钠 9.00 g，磷酸氢二钠 1.93 g，磷酸二氢钠 0.44 g，用灭菌注射用水溶解并定容至 1 L，即得到 PBS 对照液。用 PBS 对照液将 20170301 批成品稀释成 0.10 mg·mL-1的溶液，10 000 r·min-1离心后吸取上清，作为供试品 4 备用。

1.3 色谱条件 色谱柱 TSK-gel DNA-NPR (4.6 mm×75 mm，2.5 μm)；流动相：20 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷(用盐酸调节 pH至9±0.2)为流动相 A，20 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷-1 mol·L-1NaCl (用盐酸调节pH至9±0.2) 为流动相 B；柱温：25 ℃；流速：0.5 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：260 nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4 方法的验证

1.4.1 专属性 取供试品1、供试品4和PBS对照样品分别按“1.3”项下色谱条件上样检测，比对色谱图，观察在供试品1主峰出峰位置，供试品4及PBS对照液是否有干扰。

1.4.2 线性 将供试品1用PBS溶液稀释成0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mg·mL-1，按“1.3”项下色谱条件进样，每个浓度分别进样6次。计算供试品的主峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合，计算相关系数。

1.4.3 精密度 重复性：取供试品按照“1.3”项下色谱条件进样6次，测定主峰面积，计算主峰面积的相对标准偏差(RSD)。

中间精密度：测定不同检测时间的精密度变化，按“1.3”项下色谱条件进样方法在3个工作日制备供试品1，按照“1.3”项下色谱条件分别进样2次，计算主峰面积的RSD。

测定不同实验员间的精密度变化，2个实验员分别制备3份供试品1，依“1.3”项下方法进行测定，每个供试品分别测定2次，计算主峰面积的RSD。

测定不同检测设备间的精密度变化，取供试品1，采用“1.3”项下的方法分别在高效液相色谱仪Agilent 1100 和Agilent 1260 进样2次，计算不同高效液相色谱仪上供试品主峰面积的RSD。

1.4.4 耐用性 检测波长耐用性：将“1.3”项下色谱条件的波长条件改为258、260和262 nm，取供试品1分别进样2次，测定主峰面积；柱温耐用性：将“1.3”项下色谱条件的温度条件改为23、25和27 ℃，取供试品1分别进样 2 次，测定主峰面积；流速耐用性：将 “1.3”项下色谱条件的流速改为0.4、0.5和0.6 mL·min-1，取供试品1分别进样2次，测定主峰面积；流动相比例耐用性：将“1.3”项下梯度洗脱条件12 min的流动相B 设定值改为64%、66%和68%，取供试品1分别进样2次，测定主峰面积。

1.4.5 稳定性 将新配制的供试品1跟放置24 h后的供试品1分别按“1.3”项下色谱条件进行进样2次，采用面积归一化法计算供试品溶液主峰的面积百分比，比较0 h和放置24 h后的供试品溶液主峰纯度的变化。

1.4.6 检测限 取供试品1用流动相A逐级稀释浓度至 0.01、0.005、0.001 mg·mL-1和0.000 5 mg·mL-1，按浓度由低到高分别进样3次，分别计算每个浓度的信噪比，如还未达到3∶1，根据检测浓度进一步稀释。

1.5 含量的测定 取供试品1、供试品2和供试品3按“1.3”项下色谱条件进样2次，采用面积归一化法计算供试品的主峰面积百分比及RSD。

2 方法与结果

2.1 专属性研究 从检测结果可知，PBS对照液除溶剂峰外其他位置未出峰，用流动相A和 PBS配制的供试品主峰保留时间和峰高一致。结果表明辅料磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠对结核质粒DNA纯度的检测无明显干扰，专属性验证符合要求，结果见图1。

2.2 线性 结核质粒DNA浓度在0.5～2.5 μg的范围内，线性拟合系数R2为0.999 8，表明进样量与峰面积的线性关系良好。

2.3 重复性 供试品连续进样6次的主峰面积RSD为0.30%，表明该法精密度良好。 中间精密度：3个工作日测得结核质粒DNA主峰面积的RSD为0.40%，结果显示该法不同检测时间的中间精密度良好。2名实验员制备供试品测定的主峰面积RSD为0.51%，不同人员间中间精密度良好。2台检测设备测得供试品主峰面积RSD为0.23%，表明不同设备间中间精密度良好。

2.4 耐用性 为考察色谱条件的变化对结果的影响，将柱温、波长、流速和流动相的比例分别设置为不同参数，结果显示不同设置下，供试品纯度的RSD均<2.0%，表明该法的耐用性较好，详见表 2。

表2 耐用性研究结果

2.5 稳定性 供试品1在0 h时测定的纯度平均值为99.44%，在室温放置24 h后测定的纯度平均值为99.20%，不同放置时间纯度的RSD为0.14%，结果显示供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 检测限 0.001 mg·mL-1的供试品测定的信噪比(S/N)为3，因此推测 0.001 mg·mL-1时为该方法的检测限。

2.7 3批结核ag85ab DNA疫苗样品的纯度检测结果均大于95%，见表 3。

表3 3批结核ag85ab DNA疫苗样品的纯度测定结果

3 结论

结核治疗性DNA疫苗发挥治疗作用的主要成分为质粒DNA，在产品的终产物中，宿主菌的基因组DNA、RNA、蛋白质、内毒素和非超螺旋质粒等杂质均不利于质粒DNA在真核细胞的基因转染，进而影响药效作用[23]。因此结核DNA疫苗的纯度对终产品是否安全有效起到了重要作用。采用高效液相色谱法分析质粒DNA的纯度主要有分子排阻色谱法和离子交换色谱法，分子排阻法对开环、线性和超螺旋3种构型的质粒DNA无法达到较好地分离，而离子交换色谱柱是根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离，对不同构型的 DNA也具有一定的分离效果。因此本试验选用离子交换色谱法对结核治疗性DNA疫苗进行纯度的分析，并对该方法的专属性、线性、重复性和稳定性等进行验证。结果表明，该方法用于检测结核治疗性DNA疫苗中质粒DNA的专属性良好，辅料组分未对目的峰造成干扰，精密度和耐用性测试结果均良好，样品在24 h内也较稳定，验证表明本试验建立的结核DNA疫苗纯度的检测方法准确、可靠，能为新型结核DNA疫苗的质量控制提供一定依据。