正交试验法优选宣郁通经汤颗粒的提取工艺

刘群，刘伟，姜大勇

(1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2.漱玉平民大药房连锁股份有限公司,山东 济南 250100)

宣郁通经汤组方为白芍五钱(酒炒)，当归五钱(酒洗)，丹皮五钱，山栀子三钱(炒)，白芥子二钱(炒研)，柴胡一钱，香附一钱(酒炒)，川郁金一钱(醋炒)，黄芩一钱(酒炒)，生甘草一钱，水煎服，已经入选了国家中医药管理局公布的第一批100种古代经典名方目录。原方收载于《傅青主女科》(清·傅山)“妇人有经前腹疼数日，而后经水行者，其经来多是紫黑块，人以为寒极而然也，谁知是热极而火不化乎！…治法似宜大泄肝中之火，然泄肝之火，而不解肝之郁，则热之标可去，而热之本未除也，其何能益！方用宣郁通经汤”[1]。方中柴胡味苦、辛性微寒，归肝胆经，疏肝解郁；香附辛平香窜，疏肝理气，调经止痛，祛痰除湿，乃气病之总司，女科之主帅；白芍味苦酸甘，养血调经平肝止痛；当归甘温质润，为补血要药，补血活血，调经止痛；丹皮清热凉血，活血散瘀；郁金味辛苦性寒，归肝胆心经，凉血活血，行气止痛，解郁清心；栀子性味苦寒，泻火除烦，清热利湿，凉血止痛；黄芩苦寒，清热燥湿，凉血除热；白芥子辛温，利气散结，无痰不消，甘草清热祛痰，缓急止痛，调和药性；诸药配合使用，有疏肝郁、补肝血、清肝热、逐肝瘀之功，使气行血畅、湿祛痰消，故对妇科临床诸多因肝郁气滞、血瘀痰凝、湿热蕴结而引起的病症有独特的治疗作用[2]。

据邱隆等[3-4]多位现代学者考证，清代度量衡中的1两约合现在的37.3 g，处方中饮片剂量取整数37 g，宣郁通经汤处方中饮片折合现代剂量约92.5 g，量较大，不方便携带、服用，不易贮存，只能现煎现服；因颗粒剂栽药量大，故成颗粒剂便于保证药效和方便患者服用。宣郁通经汤颗粒至今未见有关制剂及提取方面报道，本试验以出膏率和芍药苷含量为评价指标，对提取工艺进行了优化，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BSA822-CW电子精密天平(德国赛多利斯)；LC-15C高效液相色谱仪(岛津)；SL-15AD紫外检测器；PDA-PD-15C自动进样器；CO-2000柱温箱(河北慧采科技开发有限公司)；ES-E型电子分析天平(上海升徽电子有限公司)；KQ2200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；KDM可调控温电热套(山东郯城华鲁电热仪器有限公司)。

1.2 试药 芍药苷对照品(20 mg，批号：110736-201936，纯度为98.1%)购自中国食品药品检定研究院；白芍(1908080362)、当归(1904120245)、牡丹皮(1905230212)、山栀子(1908140123)、白芥子(1909150110)、柴胡(1910260651)、香附(1908242523)、川郁金(1911050328)、黄芩(1912240861)、生甘草(1908210567)均符合《中国药典》2015年版(一部)中各药材项目规定，购自亳州市沪谯药业有限公司；乙腈(色谱纯)、磷酸(分析纯)购自格里斯(天津)医药化学技术有限公司；水为自制重蒸水。

2 方法与结果

2.1 水提正交试验 分别按宣郁通经汤颗粒处方称取白芍(酒炒)148 g、当归(酒洗)148 g、丹皮148 g、山栀子(炒)88.8 g、白芥子(炒研)59.2 g、柴胡29.6 g、香附(酒炒)29.6 g、川郁金(醋炒)29.6 g、黄芩(酒炒)29.6 g、生甘草29.6 g，共9份，每份计740 g，参考相关文献[5-6]，按表1进行正交试验，以提取液中芍药苷含量和出膏率为指标进行评价，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 出膏率测定 分别精密量取各试验提取液80 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，称重，计算。

2.3 芍药苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统用性试验 以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05%磷酸溶液-三乙胺(14∶86∶0.02)为流动相，检测波长230 nm[7]；论板数按芍药苷峰计算应不低于3 000。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备

2.3.3.1 供试品溶液1 精密量取提取液4 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3.2 供试品溶液2 取本品细粉3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液滤过，即得。

2.3.4 阴性供试品溶液 取不含白芍的宣郁通经汤颗粒，同“2.3.3.2”项下方法，制得阴性供试品溶液。

2.3.5 线性与范围 精密称取芍药苷对照品12.46 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为线性溶液。精密量取各线性溶液10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以芍药苷浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=14 271X+248.83，R2=0.999 7；结果芍药苷在24.45～85.56 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度 取芍药苷对照品溶液(56.74 μg·mL-1)连续进样6次，结果峰面积RSD为1.37%，仪器精密度良好。

2.3.7 重复性 取同一批宣郁通经汤颗粒按“2.3.3.2”项下制备6份样品，测定芍药苷含量，结果RSD为0.94%，方法重复性良好。

2.3.8 稳定性 取同一份宣郁通经汤颗粒供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，记录峰面积，RSD为0.96%，供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.9 加样回收率试验 称取同一批宣郁通经汤颗粒(1.81 mg·g-1)6份，每份约1.5 g，精密称定，照“2.3.3.2”项下方法处理，分别加入绿原酸对照品溶液(1.317 1 mg·mL-1)2 mL，混匀后测定，计算绿原酸回收率，平均回收率为99.52%，RSD为0.42%，回收率良好(见表2)。

2.4 水提工艺确定 正交试验结果见表3，方差分析结果见表4～5。结果以提取液芍药苷含量和出干膏率为指标进行提取评价，从正交试验直观与方差分析可知，影响宣郁通经汤提取效果的因素均为A>B>C>D，因素A3明显优于A2与A1，故选A3；B3>B2>B1，C3与C2差别较小，D1、D2与D3无差别，故优选B3C2D1；综合生产成本和操作的可行性等因素，优选提取工艺为A3B3C2D1，即宣郁通经汤最佳工艺为饮片加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min。

表2 回收率计算结果

表3 因素水平表

表4 出干膏率方差分析

表5 芍药苷含量方差分析

2.5 工艺验证 称取宣郁通经汤颗粒处方中药材各3份，每份740 g，分别按优选工艺(加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min)提取，制成颗粒剂，测定，结果见表6。

表6 验证试验结果表

结果表明，以优选的提取工艺验证3批，该工艺的出膏率和宣郁通经汤颗粒中芍药苷含量稳定。

3 讨论

3.1 根据古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定，古代经典名方制备方法除成型工艺外，其余制备方法应当与古代医籍记载基本一致，宜用水煎[8]，为保持宣郁通经汤传统经典名方的特点，本试验以水提取。

3.2 传统的中药煎煮方法一般要求先将中药用冷水浸泡20～40 min后才进行煎煮，药材在煎煮前保持适当的浸泡时间可以充分润透[9-10]，经试验，宣郁通经汤中的饮片吸水量约为饮片的1.5倍左右，加水量少，不易药材中有效成分的提出，煎煮时间太长，易破坏有效成分，以饮片的干膏率和芍药苷含量为指标，试验了浸泡时间，加水量，提取次数与提取时间，优选出了较为合理的提取工艺。为验证优选工艺(饮片加8倍量水浸泡30 min，提取3次，每次60 min)的可行性，进行了3批验证试验，结果优选的工艺稳定、可行。

3.3 宣郁通经汤每日饮片量约92.5 g，水煎服，汤剂量较大，不方便患者服用；处方中饮片水提出干膏率约28%(约26 g)，按日分3次服用计，每次服用干膏8.6 g，只适合于制成颗粒剂；在颗粒成型试验中分别以稠膏与不同辅料试验，使用辅料较多，制成颗粒量较大，不方便患者服用；与为减少服用量，宜将稠膏干燥，粉碎成细粉与辅料混匀，以适宜浓度的乙醇为润湿剂制粒。