热灭活乳双歧杆菌BL-99缓解小鼠结肠炎及调节肠道菌群的功能研究

赵雯，刘伟贤，巴根纳，樊启程，孙超，王妮妮，洪维鍊

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特010110）

0 引 言

肠道不仅是哺乳动物最大的消化吸收器官，也是机体最重要的防御屏障。正常肠道具有将肠腔内物质与机体内环境隔离的功能，可以防止致病性抗原侵袭，维持机体内环境稳态，是机体防御的第一道防线[1]。肠道中定植着1 000 多种细菌，包括益生菌、致病菌、真菌、病毒等，通常情况下，肠道微生态系统与机体保持着一种平衡状态，但若机体处于应激等不良状态[2]或一次性接触到大量病原菌[3]，这种平衡关系则会被打破，损伤超过机体的自我修复水平，最终引起肠道炎症产生[4]。结肠炎是炎症性肠病的一种，以反复发作的肠道慢性炎症为主要表现，其发病机制目前仍不明确，但研究表明UC 的发病与肠道菌群的失调密切相关[5-7]。

双歧杆菌（Bifidobacterium）是革兰氏阳性菌，广泛分布于肠道、粪便、口腔等环境中[8]。双歧杆菌是人体肠道中数量众多的一种有益菌，作为肠道健康的指示菌，其丰度受到各种因素的影响[9]。研究发现，双歧杆菌具有调节机体免疫功能、抑制致病菌的黏附和增强肠道屏障等有益功能[10-12]。已有研究证实，双歧杆菌CCFM683 可以通过改善肠道组织学损伤，保护结肠粘膜的完整性，并显著降低炎性因子的表达来缓解DSS 诱导的小鼠结肠炎[13]。目前我国益生菌功能性的研究多局限于活菌，对于灭活益生菌的研究还比较少，而国外尤其在日本，以灭活双歧杆菌为主的益生菌制品产业形成了一定的规模[14]。研究表明，灭活双歧杆菌可以诱导巨噬细胞分泌抗炎因子，可能会增加其抗炎作用；还有研究表明，灭活的双歧杆菌具有与活菌相同或相近的免疫学活性，两者均可提高小鼠肠液中sIgA 水平[15]。

本研究以灭活乳双歧杆菌BL-99 为干预物，探究BL-99 是否对患病小鼠有炎症缓解作用以及对健康的小鼠具有益生作用。因此，本研究构建了结肠炎小鼠模型组，探究灭活乳双歧杆菌BL-99 对正常小鼠肠道菌群的调节作用，旨在了解灭活双歧杆菌的抗炎机制及调节肠道菌群的功能作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验菌株及动物

乳双歧杆菌BL-99 菌粉，由内蒙古乳业技术研究院有限责任公司提供；健康BABL/c 雄性小鼠112 只，购自北京华阜康生物科技有限责任公司，饲养于中国疾病预防控制中心动物房。

1.1.2 试剂与设备

ELISA 试剂盒；DSS，美国MP；一次性离心管，由泰州市苏医医疗器械有限公司提供；一次性培养皿，由青岛金典生化器材有限公司提供；厌氧产气袋，由日本三菱公司提供；电子天平；恒温培养箱；密封培养罐；酶标仪；分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 灭活菌悬液的配制

根据实验要求人体需求量及样品规格，参考20 g小鼠与70 kg 成人体表面积比例参数0.0026，以0.4 mL/20 g 为小鼠灌胃体积。取833.33 mg 乳双歧杆菌BL-99 菌粉溶解到 50 mL 无菌PBS 溶液中，得到1×109菌悬液，然后采用10 倍的梯度稀释得到所需中、低梯度的样品。配制完成后，100 ℃水浴加热灭活20 min，冷藏备用。

1.2.2 动物分组及模型的构建

健康BABL/c 雄性小鼠112 只（n=14 只/组），鼠龄6～8 周，体重20～22 g ，维持室温（25±2 ℃），相对湿度（55±2）%，12 h/12 h 昼夜交替光照，自由进食和饮水。每组分两笼饲养，每笼7 只，使用苦味酸编号，普通饲料适应性喂养5 d。具体分组及样品量见表1。除对照组外，编号为2-5 的分组为结肠炎小鼠实验组，需要进行DSS 诱导的实验性结肠炎模型的建立，具体方法为在实验过程第13 天，配制5.0%的DSS 水溶液替代饮水，自由饮用7 d，正常组饮用蒸馏水，并每日观察小鼠体征变化。编号为6-8的分组为菌株调节正常小鼠的肠道菌群实验组。两组均在适应性培养5 d 后，以灌胃方式灌胃小鼠，灌胃体积为0.4 mL/20 g的灭活乳双歧杆菌BL-99，灌胃周期为14 d。

1.2.3 样品采集与处理

每天观察小鼠活动，耗食量及大便性状，并定期称量小鼠的体重。在实验结束后，结肠炎组的小鼠采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清。分离小鼠结肠，以PBS 冲洗多次后，测量长度，剪切2/3 存于离心管中，-80 ℃保存。1/3 储存于10%福尔马林溶液中固定备用。剥离完整脾脏，称重，计算脾脏指数。肠道菌群组在灌胃前（6 d）与灌胃后（19 d）使用无菌医用胶带及镊子无菌条件下采集每组小鼠粪便，每只2～4 粒，存放于灭菌离心管中，编号，-80 ℃冷冻条件下保存备用。

表1 动物模型分组

1.2.4 结肠病理组织HE 染色及评分

参考Martin[16]的研究方法，将结肠放入福尔马林溶液固定后，依次经过脱水、浸蜡、包埋、切片、捞片和烤片，脱蜡复水等步骤处理后，进行HE 染色，最后在光学显微镜下观察结肠组织结构。

采用Fedorak 组织学积分标准进行组织学评分[17]。组织学损伤评分标准如表2所示。

表2 组织学损伤评分标准

1.2.5 免疫细胞因子检测

对结肠炎小鼠的血清和结肠中的TNF-α、IL-6、IL-10 采用酶联免疫测定法，按照ELISA 试剂盒的操作说明书进行测定。

1.2.6 肠道菌群多样性的检测

取-80 ℃冷冻条件下保存的肠道菌群组小鼠粪便，采用粪便总DNA 提取试剂盒提取总DNA。肠道菌群多样性是基于IIIumina HiSEQ 测序平台，利用双末端测序的方法，构建小片段文库进行测序。通过对Reads 拼接过滤，OTUs 聚类，进行物种注释 he 丰度分析，可以解释样品的物种构成，并进一步进行多样性分析和显著性物种差异分析等等，挖掘样品之间的差异。

1.2.7 统计分析

所有数据利用Excel 和SPSS 18.0 软件处理，采用均值±标准差表示，以单因素方差分析进行显著性检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 DSS诱导小鼠结肠炎的特征观察

在实验的0～5 d，各组小鼠毛色光滑，精神活跃，反应灵活，正常进食，无腹泻及血便等情况，大便呈球形或条形；DSS 组与高、中、低剂量组小鼠均经过5%的DSS 诱导7 d 后形成了实验性结肠炎模型。造模期间的前3 天，小鼠饮水正常，体重基本正常，但出现慵懒、厌食，毛色开始暗淡，DSS 组情况较为严重。造模第3天，DSS 组与高、中、低剂量组小鼠均出现腹泻，DSS 组小鼠开始便血，而高、中、低剂量组小鼠出现血便的时间与DSS 组比较推迟1～2 d。且随着造模时间加长，血便症状加剧，造模结束小鼠体重及活动量明显减少，灌胃灭活乳双歧杆菌BL-99 的高、中、低剂量组相比较DSS 组情况较为好转，毛色逐渐恢复光泽，活动量逐渐增加。正常对照组无上述症状出现，活动如常，进食量逐渐增加，大便正常，体重增加。

2.2 乳双歧杆菌BL-99对小鼠常规指标的影响

灭活乳双歧杆菌BL-99 作用于DSS 诱导的小鼠结肠炎的体重变化结果如图1 所示。在灌胃小鼠的第5 天、第12 天和第19 天，分别对每组小鼠进行体重测量。在第5 天时，小鼠体重的各组间比较无显著性差异（P＞0.05）；表明实验开始时小鼠状态一致，可排除小鼠体重不同造成的实验差异；给予7 d 的灭活乳双歧杆菌BL-99 后，各组小鼠体重均有所增加；而在5%DSS 代替饮水7 d 后，除对照组外小鼠体重均显著降低（P＜0.05），这与Zhou[18]的结果相一致，而对照组体重无显著性变化，表示小鼠结肠炎造模成功。与DSS组相比，灌胃灭活乳双歧杆菌BL-99 的高、中、低剂量组的小鼠体重有所上升，但无显著性差异（P＞0.05）。

测量各组小鼠结肠长度结果比较发现，造模后，DSS 组和高、中、低剂量组小鼠的结肠长度均显著低于对照组（P＜0.05），说明5%DSS 诱导的结肠炎会导致小鼠肠道损伤，长度缩短[19]。高、中、低剂量的灭活BL-99 菌悬液灌胃后，各组小鼠结肠长度有所增加，但与DSS 组比较无显著性差异（P＞0.05），说明灭活BL-99 菌悬液短期的灌胃对小鼠结肠长度有所缓解，但没有形成统计学差异。同时低剂量组的灭活BL-99菌悬液对小鼠结肠长度的恢复有更大的影响。

图1 乳双歧杆菌BL-99对结肠炎小鼠常规指标的影响

2.3 小鼠脾脏重量及指数

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞，脾脏的重量与其功能及免疫细胞数量有关[21]。由表4 可以看出，与对照组比较，DSS 组和灭活高、中剂量组小鼠的脾脏指数均显著高于对照组（P＜0.05），各组之间的差异不显著，这是因为DSS 诱导作用下，脾脏中的淋巴细胞和免疫细胞发挥其免疫作用，相关细胞大量增殖，同时由于小鼠的体重降低，从而引起小鼠脾脏指数升高。动物模型组给予灭活乳双歧杆菌BL-99 灌胃后，高、中、低剂量组与DSS 组无显著性差异（P＞0.05），说明经炎症造模后，各组小鼠机体均产生了炎症反应，而灭活低剂量组在脾脏指数上具有降低的趋势，且与对照组无显著差异（P＞0.05），可能具有减少机体炎性反应的功能。

表3 小鼠脾脏重量/指数

2.4 乳双歧杆菌BL-99改善结肠组织病理学结构

从图2 的组织学观察可以看出，对照组小鼠具有完整的结肠上皮细胞，并可看到清晰的隐窝结构和杯状细胞；DSS 诱导形成的模型组结肠炎小鼠组织不能看到完整的结肠上皮细胞，同时出现隐窝不完全、杯状细胞损坏的现象，损坏面积均在50%以上，部分小鼠隐窝完全消失，杯状被完全破坏[21]。另外还可以观察到小鼠炎性细胞浸润，如中性粒细胞和淋巴细胞等。小鼠经灭活的BL-99 灌胃后DSS 造模，出现了炎性细胞浸润程度降低、病变深度主要在黏膜下层，基底隐窝破坏较少，切片病变范围也较小，其中高剂量组炎症反应较为严重，其病变范围较大，约在50%左右，中、高剂量组病变范围较为局限，大部分在0～25%范围内。结果表明灭活乳双歧杆菌BL099 可以在一定程度上修复肠道细胞，减轻DSS 模型小鼠的结肠炎症程度，维护肠道屏障的完整性。

采用Fedorak 组织学积分标准的结果如图2 所示，与DSS 组比较，灭活BL-99 低、中、高剂量组的组织学伤损评分均显著低于DSS组（P＜0.05），说明灭活乳双歧杆菌BL-99 具有减轻小鼠结肠炎症症状的作用。BL-99 高剂量组的评分虽然与低、中剂量组相比较高，但与DSS 组比较仍具有统计学意义，且结肠组织病理学评分结果与结肠HE 染色结果相一致。

2.5 结肠免疫细胞因子的表达

图2 结肠组织的HE染色及结肠组织损伤评分

IL-6 为一种多功能的关键细胞因子，能够调节其他细胞因子的表达[22]。TL-6 能刺激B 细胞的分化，诱导免疫球蛋白的分泌。临床发现，UC 患者中IL-6 水平随着患者的症状改变而改变，当患者炎症反应减缓时，可以同时观察到中IL-6 水平的缓慢减少[23]。而TNF-α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，广泛分布在外周血循环中。在病理改变下，TNF-α大量分泌，以致对机体产生损害作用[24]。DSS 诱导的实验性结肠炎的过程中，IL-6、TNF-α作为促炎因子，其表达水平的高低与结肠研中炎症程度的深浅有着密切的关系[25]。如图3 所示，DSS 组小鼠结肠IL-6、TNF-α显著升高，说明DSS 诱导小鼠发生免疫反应，产生大量的炎性细胞因子。而灌胃灭活BL-99 高、中、低剂量组的小鼠结肠IL-6、TNF-α与DSS组比较均呈现下降趋势，其中低剂量组的IL-6 和TNF-α与DSS 组相比显著下降（P＜0.05），说明灭活乳双歧杆菌BL-99 灌胃过程中，益生菌可直接对肠道炎症反应产生相关的抑制作用，抑制炎性因子的分泌。

已有研究证实，缺乏IL-10 的小鼠表现出严重的肠道炎症，且IL-10 在动物结肠炎模型中表现良好的治疗效果[26]。本研究中，DSS 组IL-10 与对照组比较虽无显著性差异，但在数值上出现了上升趋势，这可能是由动物机体自身免疫反应为导致的。灌胃灭活BL-99 低、高剂量组的小鼠结肠抗炎因子IL-10 含量均与对照组相比显著增高（P＜0.05），说明灌胃灭活BL-99 可以促进结肠炎中IL-10 的产生，增强抗炎作用，缓解DSS诱导的结肠炎症状。

2.6 肠道菌群的变化

2.6.1 小鼠肠道微生态菌群Alpha多样性指数

图3 结肠炎小鼠的免疫细胞因子的表达

Alpha 多样性反应的是单个样品物种丰度及物种多样性，对菌群丰度指数OTU、ACE、Chao，物种多样性指数 Shannon 和 Simpson 进行分析比较[27]，由图 4 可发现灌胃灭活BL-99 前，各组动物菌群丰度指数ACE、Chao，物种多样性指数 Shannon 和 Simpson 均无显著性差异（P＞0.05），说明灌胃前各组小鼠肠道菌群相对丰度与多样性无显著性差异，各组小鼠肠道菌群结构趋于一致；灌胃后，灭活BL-99 高、低、中剂量组的小鼠肠道菌群OTU、ACE、Chao 和Simpson 与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05），这可能是由于灭活的乳双歧杆菌在肠道内发挥功能的主要是其含有的小分子功能肽、维生素、游离氨基酸等，不能在肠道内进行生长繁殖导致的。灭活BL-99 低、中剂量组的小鼠肠道菌群Shannon 指数显著高于对照组（P＜0.05），说明与对照组比较，灭活的中、低剂量BL-99 灌胃后的小鼠肠道中菌群的多样性增加。

分析灌胃灭活BL-99 的低、中、高剂量组的小鼠肠道菌群，OTU、ACE、Chao 均呈现出增加的趋势，且可检测到物种种类增加，说明灌胃后小鼠肠道菌群物种丰度增加。

图4 肠道菌群Alpha多样性指数

2.6.2 小鼠肠道微生态菌群门水平的组成与分布

由图5 所示，与对照组比较，灌胃灭活BL-99 前低、中、高剂量组肠道菌群相对丰度均无显著性差异（P＞0.05）；灌胃低剂量的BL-99 可以导致小鼠肠道菌群的变形菌门的相对丰度显著降低，厚壁菌门的相对丰度显著增高（P＜0.05）；灌胃中剂量的BL-99 可以导致小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度显著降低，厚壁菌门的相对丰度显著增高（P＜0.05）；高剂量BL-99 组小鼠肠道菌群拟杆菌门、变形菌门的相对丰度降低，厚壁菌门的相对丰度增高（P＜0.05）；灌胃灭活BL-99 后，小鼠肠道菌群拟杆菌门和变形菌门的相对丰度总体呈现下降趋势，而厚壁菌门的相对丰度显著升高（P＜0.05），主要原因为益生菌乳双歧杆菌BL-99 为放线菌门，通过灌胃在肠道中定植，增加肠道菌群中厚壁菌门的含量，同时益生菌的增加，一定程度上限制了肠道拟杆菌门中条件致病菌和变形菌门中肠杆菌的增殖，在门水平上起到调节肠道菌群的作用。

2.6.3 灌胃前后小鼠肠道微生态菌群在属水平上的分析

如图6 所示，在属水平上，灌胃灭活BL-99 前各组小鼠肠道菌群相对丰度与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。灌胃后，与对照组比较，BL-99 低剂量组小鼠肠道菌群中梭菌属、肠球菌属的相对丰度降低，双歧杆菌属的相对丰度显著增高（P＜0.05）；BL-99 中剂量组小鼠肠道菌群梭菌属、肠球菌属相对丰度降低，双歧杆菌属相对丰度增高（P＜0.05）；BL-99 高剂量组小鼠肠道菌群梭菌属拟杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、肠球菌属的相对丰度降低，双歧杆菌属相对丰度增高（P＜0.05）。综合以上结果表明，灭活BL-99 可降低肠道菌群中拟杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、肠球菌属含量，增加双歧杆菌属的含量。

同时比较图5 和图6 可以得知，益生菌增加肠道菌群的作用在属和门两个等级上均呈现相关性。原因在于益生菌BL-99 为双歧杆菌，双歧杆菌属在肠道内的增加导致双歧杆菌科的菌群增加，从而引起放线菌纲和放线菌门菌群的增加，同时双歧杆菌属于肠道益生菌，促进了厚壁菌门的增长。因此，BL-99 双歧杆菌可以增加肠道内双歧杆菌属的相对丰度，降低拟杆菌属、梭菌属、肠杆菌属和肠球菌属相对丰度，具有调节肠道菌群功效。

3 结 论

由于肠道微生物可以吸收宿主自身难以消化吸收的成分及分泌到肠腔中的物质，所以肠道微生物的组成会随着机体摄入的食物成分的改变而改变。因此，膳食结构是影响肠道菌群结构和功能的重要因素，不当的饮食会扰乱肠道微生物和宿主之间的稳态平衡，造成肠道菌群失调进而诱发多种肠道疾病。摄入益生菌添加食品可调节肠道微生物群结构，从而达到效预防甚至是治疗相关疾病的效果。摄入一定量的灭活益生菌、益生菌细胞碎片及益生菌代谢产物，也同样具有很好的复合免疫作用，可以抑制致病菌增殖，调节肠道菌群平衡，有益于宿主健康。灭活乳双歧杆菌BL-99 灌胃小鼠后，在一定程度上降低结肠组织伤损评分，改善了肠道损伤的程度；并通过降低炎性细胞因子IL-6、TNF-α 的含量，增加抗炎因子IL-10 含量缓解结肠炎。综合以上结果，灭活BL-99双歧杆菌具有减轻DSS 诱导的结肠炎症症状的功效。同时灭活的BL-99 双歧杆菌对正常小鼠肠道菌群具有调节作用，灭活的乳双歧杆菌BL-99 能够增加双歧杆菌属和乳杆菌属菌群含量，显著促进双歧杆菌和乳酸菌的生长，具有调节肠道菌群的功效，对健康小鼠的肠道也具有增益的效果。