牛乳中常见热敏性生物活性物质的研究进展

扶晓菲，邢倩倩，游春苹

（乳业生物技术国家重点实验室上海乳业生物工程技术研究中心光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海200436）

0 引 言

牛乳，尤其是牛初乳，营养价值丰富并与人乳组成相似，是一种来源天然且经济高效的滋补食品[1]。除乳糖，蛋白质（主要是酪蛋白、乳清蛋白），乳脂肪，矿物质（如钙、铁），维生素等常规营养素外，牛乳中还存在诸多生物活性物质，例如β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）、α-乳白蛋白(α-lactoalbumin, α-La)、乳铁蛋白(Lactoferrin, Lf) 、免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase, LPO)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、酪蛋白源和乳清蛋白源的生物活性肽，不饱和脂肪酸，如亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)、反式脂肪酸(Trans fatty acids , TFA)、激素（如褪黑素）及细胞因子（如白细胞介素）等，这些生物活性物质的摄入对人体健康有益，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化，防控慢性病、调节免疫等方面均发挥潜在价值[2]。特别是在儿童常见传染性疾病的日常防控中，牛乳及其发酵乳制品也一直被备受推崇，牛奶等高蛋白食物的摄入对于提高免疫力而言是必要的[3]。

对生牛乳进行适度的热处理，有助于杀灭牛乳中的致病微生物，延长产品货架期。但过度的热处理，则会导致牛乳中乳糖结构改变，蛋白质变性，β-Lg、α-La、Lf、Ig、LPO、LZM 等活性物质失活，甚至可能产生通过美拉德反应产生糠氨酸、糠醛类化合物、糖基化终产物等有害物质，既改变了乳品的营养和风味，也影响了产品的品质[4]。一般生牛乳经均质（65 ℃）、升温后进入杀菌阶段，较为多见的4 类分别是：低温长时（Low temperature long time, LTLT）巴氏 杀 菌（61.1～65.6 ℃, 30 min），高温短时（High temperature short time, HTST）巴氏杀菌（75～85 ℃, 15 s），超巴氏杀菌（125～138 ℃, 2 s）和超高温灭菌（Ultra high-temperature sterilized, UHT, 135～140 ℃ , 4 s），也有经包装后再灭菌（115～120 ℃，20～30 min）[5]得到商业无菌产品。牛乳中很多生物活性物质是热敏性的，不同的热处理方式对生物活性物质的影响大不相同，既有报道指出均质化处理提高了乳清蛋白的乳化稳定性，巴氏杀菌在有效杀菌的同时对活性物质影响有限，而超高温灭菌则对活性物质的保留相对不利，因此这些生物活性物质具备成为牛乳热损指标来衡量乳品质量的潜力[6-7]。本文归纳了牛乳热敏性的生物活性物质的常见生理功能，探究不同热处理方式对其产生的影响，尝试为牛乳热敏指标的筛选和牛乳加工工艺优化及乳品质量评价指标的完善作出理论参考。

1 常见生物活性物质及其功能特性

1.1 活性蛋白及常见酶类

酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中主要的蛋白，pH 为4.6 时，不溶性酪蛋白约占80%，热变性温度范围约为160～200 ℃，在常见的几种热处理温度下相对稳定[8]。而可溶性的乳清蛋白则约占乳蛋白的20%，但更具热敏性，其中牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)在牛初乳及常乳中均少量存在，本文不再过多讨论BSA[9]。乳清蛋白又包含β-Lg、α-La、Lf、Ig 等具有生物活性的乳蛋白，以及与之相互作用的LPO 及LZM等，乳清蛋白多自65 ℃起开始变性，变性率与温度正相关，变性后的乳清蛋白之间，乳清蛋白与酪蛋白胶束也会发生热凝聚，进而影响牛乳品质和功能特性[10-11]。

β-Lg 和α-La 是牛乳清蛋白的主要成分，β-Lg 常与脂肪酸或维生素等疏水性配体结合而具备营养特性，其他功能特性尚未完全明确，可能与输送脂肪酸至肠细胞有关[12]。一项针对白藜芦醇的功能特性改进的研究指出，在巴氏杀菌的加工工艺条件下，白藜芦醇和β-Lg 的相互作用，显示出了β-Lg 对白藜芦醇热损伤导致的化学变化的保护作用，进而表现出提高其的抗氧化性和热稳定性[13]。α-La 则具有最佳的氨基酸配比，作为一种色氨酸含量最为丰富的乳清蛋白，在抗氧化、提升认知，改善癫痫具有明显作用，它在牛乳和人乳中的含量存在差异，因此也被运用到婴儿配方食品中来保证婴儿的生长发育[14-15]。

Lf 和Ig 是牛乳两类主要的生物活性物质，Lf 是一种与铁离子结合的多功能乳活性蛋白，最初于1939 年被发现且在牛初乳中较为丰富的存在，乳铁蛋白的功能特性有抗菌抗炎、参与局部免疫以及与Ig 发挥协同作用[16]。此外，Svetlana[17]等也首次在7 只不同品种的乳牛中分离并证实了在Lf 具备过氧化物酶、蛋白酶、磷酸酶等催化活性。常见Ig 种类有IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE 5 种，其中 IgA 是人乳中主要免疫蛋白，Ig 作为牛乳中关键抗菌蛋白，在免疫防御机制中不可或缺[18-19]。报道指出，Lf 和Ig 类乳抗菌蛋白的水平直接影响着乳牛对乳腺炎的易感性，进而可能影响牛乳品质及货架期[20]。

LPO 是牛乳抗菌系统中含量最高的基础酶之一，借助乳过氧化物酶系统的硫氰酸盐和H2O2，催化多类微生物失活，由于其广泛的抗菌性能而对免疫系统具有保护作用，并在延长乳品货架期寿命存在潜在应用前景[21-22]。例如Manabu 等实验发现，相较单独作用组，LPO 和Lf 的联合使用在改变白念珠菌的细胞活性和菌丝形态中都更加显著，并展现出了良好的协同抗菌活性[23-24]。当然，LZM 作为可与免疫球蛋白和乳铁蛋白发生协同作用的酶蛋白，也对多种细菌表现出抗菌活性[25]。除了牛乳，人体口腔及泪液中也检测到LPO 和LZM，一项针对老年人口腔微生物群的研究表明，牙菌斑中革兰氏阴性菌数量在经干预后显著减少，提示了LPO 和LZM 添加至口腔卫生制剂用于口腔健康管理的潜在意义[26]。

根据溶解度归纳得到的乳活性蛋白一般变性顺序是ALAC、β-Lg、Ig，但也在其他报道中见到不同热敏性大小排序，如Ig、β-Lg、α-La，既有报道关于常见活性物质及功能特性详见表1[4]。此外，牛乳中的生物活性物质也会在热处理过程中发生乳清蛋白之间、乳清蛋白与酪蛋白、乳清蛋白与乳糖的相互结合及凝集，因此对牛乳热敏性生物活性物质的充分研究，有利于充分保留热处理过程中的活性物质，从而进一步拓展乳清蛋白在功能性食品配料中的开发和应用[10,27]。

1.2 生物活性肽

酪蛋白和乳清蛋白经水解得到的各类生物活性肽是近些年来备受关注的又一大类生物活性物质，其中以免疫活性肽、降血压肽、抗血凝肽等为代表的的酪蛋白生物活性肽来源最为丰富和广泛，此外还包括Ig、Lf 在内的其他乳清蛋白源抗菌肽等[28]。这些乳源性生物活性肽经体外和体内实验证实在免疫系统、消化系统、心血管系统、神经系统中表现出提高天然免疫、抗氧化抗菌、防控动脉粥样硬化等慢性疾病的潜在价值，乳蛋白衍生肽也逐渐成为功能性食品和药物的研发方向[29-30]。

酪蛋白源生物活性肽研究领域多聚焦于4 个方面：（1）抗菌活性、是有效的细菌抑制剂；（2）免疫调节作用，例如酪蛋白水解物对人体T 细胞具有抗炎作用，可降低促炎核心细胞因子IL-6的释放；（3）降血压作用，作为血管紧张素转换酶抑制剂来发挥作用；（4）促进成骨细胞增殖，经水解的多肽表现出显著的增殖效应[31-33]。除此之外，还包括促进铁钙锌等矿物质吸收、影响神经放松以及抵抗细胞凋亡等潜在功能特性，酪蛋白源生物活性肽的生物活性受水解作用后生成肽的大小和序列影响[32,34]。

表1 常见的活性物质及功能特性

乳清蛋白源生物活性肽同样表现出诸多类似的生理功能[28]。由于抑制血管紧张素转换酶和二肽基肽酶是治疗糖尿病和高血压的有效途径，Lacroix 等[35]借助体外试验发现乳清蛋白水解物表现出了血管紧张素转换酶和二肽基肽酶的抑制活性，且对前者的抑制作用更为明显，体现了乳清蛋白源生物活性肽的药物应用潜力。Lf 对粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等一系列细菌和真菌产生抗菌作用，而以Lf 为前体经胃蛋白酶水解生成后的乳源生物活性小肽，抗菌活性更强[28,36]。

1.3 乳脂类及其他

除乳活性蛋白和生物活性肽外，牛乳中的一些其他活性物质也同样作为调节因子，在机体内表达生理功能。例如激素、多种生长因子，不饱和脂肪酸（CLA、TFA）、细胞因子、核苷和核苷酸等。乳脂类中典型的活性物质是CLA 和TFA，二者含量变化呈现正相关性，CLA 被报道具有抗动脉粥样硬化和抗癌等特性，但尚有待更多的研究佐证，乳脂肪中还含有许多必需氨基酸以及神经鞘磷脂等脂类，均参与多种生化反应，并在人体心血管系统及神经系统中发挥积极作用[37]。牛乳中激素含量不高但种类丰富，常提及的有雌激素、褪黑素以及由垂体、腺体分泌的各类激素，具有促进生长发育等作用，例如对于不能分泌褪黑素的婴儿而言，研究发现褪黑素增补具有改善婴儿的睡眠和减少婴儿绞痛的潜在效果，当然激素也可以协同各类生长因子来表达特定性能[38-39]。Yuen 等[40]指出胰岛素样生长因子-I 具有类胰岛素的特性，在诸如糖尿病等类型的胰岛素敏感性的防治中具有应用前景。

2 热处理对生物活性物质的影响

热处理导致的活性物质的改变主要体现在结构和性质两方面的改变，本节主要从均质、巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌、热喷雾干燥4 个典型热处理工艺考量活性物质的改变。热加工过程中，牛乳中发生的一系列变化包括乳清蛋白变性及相互热凝聚（如α-La 和β-Lg 之间）、酪蛋白与乳清蛋白通过疏水键或氢键聚集并随加热时间的延长而进一步加强、乳糖和蛋白的相互作用导致美拉德褐变、巯基化合物及不溶性物质形成[41]。既有文献报道中常见热处理工艺导致的活性物质热损详见表2。

2.1 均质

均质是乳品加工过程中必不可少的工艺之一，其目的是得到合适粒径的乳脂肪球，充分乳化牛乳体系并使之稳定，65 ℃、20 MPa是一个理想的均质工艺参数，一般的预热和均质条件下仅少数乳清蛋白结构发生变化，即少数蛋白变性，无需担心过度均质对健康产生不利影响，均质热损害的相关报道并不多见[42-43]。值得一提的是，Pereda 等[44]通过比较经超高压均 质（200～300 MPa，30～40 ℃）和高 温巴 氏杀 菌（90 ℃, 15 s）两种杀菌工艺得到的奶样中变性β-Lg和340 nm 的吸光度值，证实前者作为一种非热或低热处理工艺，其对牛奶中生物活性物质的热损害更小，提出了超高压均质技术代替高温巴氏杀菌技术的可能性。类似的，一项研究超高压均质工艺对乳过氧化物酶体系影响的研究也指出，LPO 对超高压均质表现出耐热性，即在100 ～250 MPa 的压力下，观察到酶活性增加约20%，而当压力升为300 MPa 时，酶活性减少约30%[45]。

2.2 巴氏杀菌

传统的热巴氏杀菌有2 种类型，LTLT 巴氏杀菌和HTST 巴氏杀菌，热巴氏杀菌对牛乳中各类营养和活性物质具有不同程度的影响。整体可归纳如下，（1）酪蛋白胶束直径与热加工温度呈正相关，并可与变性的乳清蛋白相互作用[4]；（2）Ig 对温度变化最为敏感，IgG、IgA、IgM的热稳定性呈递减趋势，IgG在pH为5.5 时变性最快，酸介质可能对IgG 变性影响最小[46]；（3）乳清蛋白中β-Lg 对温度变化敏感，72～75 ℃左右开始去折叠化，暴露巯基的同时伴随着或轻或重的蒸煮味道[9]；（4）α-La 是一种金属结合蛋白，热敏性较β-Lg 弱，经78 ～94 ℃的热处理，热损失程度随温度和处理时间的增加而增加，油酸可能通过改变α-La的三级结构而对该蛋白的活性产生影响[47]；（5）LPO的变性终点温度为85 ℃，因此可以作为衡量杀菌强度的热敏性指标[4]；（6）巴氏杀菌过程一定程度上也会影响Lf，变性趋势与Ig 较为接近，容易受温度和pH 的影响，当 pH 为 5.5 时牛乳热损率最高，Wakabayashi 等人也补充报道了在pH 为4，90～100 ℃热处理条件下Lf相对稳定[46]，Lf作为一种糖基化蛋白，与之结合的特异聚糖的主要结构也决定了其热稳定性；（7）对比发现，LTLT 巴氏杀菌较 HTST 巴氏杀菌对β-Lg 和α-La 两类蛋白的热损伤小[9]。另外一项比较微波巴氏杀菌和传统巴氏杀菌的研究，也报道了80 ℃的高温条件下，仍可以在经微波杀菌的奶样检测到过氧化物酶的酶活[48]。

2.3 超高温瞬时灭菌

超高温瞬时灭菌处理工艺对活性物质的热损程度要高于巴氏杀菌，多数常见活性物质热损率高，热变性明显。具体表现为：（1）酪蛋白胶束直径继续扩大[4]；（2）乳清蛋白在不同温度下的变性程度各不相同，一般认为乳清蛋白在60 ℃或65 ℃起开始少量变性，在85 ℃或95 ℃就已完全变性，但也有报道指出α-La 相对而言较为耐热，有时在超高温灭菌条件下仍可少量存在，其他乳清蛋白如Ig，Lf 在超高温条件下热变性报道不多见，这可能与乳清蛋白在高温下完全变性有关[4,49]；（3）Datta 等[41]归纳前人关于超高温处理工艺的报道中提及，相较间接加工，直接加工方式更有利于保留牛乳中非变性的β-Lg。此外也有研究指出，保温时间相对较长的二次灭菌工艺，尽管热处理温度稍低于超高温灭菌，该工艺对牛乳品质造成的过度褐变等不良影响更甚，因此需要综合考虑温度和时间两因素对活性物质保留的不同影响[8]。

表2 常见热处理工艺导致的活性蛋白热损伤 %

2.4 热喷雾干燥

婴幼儿配方奶粉常见有湿法、干法、干湿复合3 种加工工艺，热喷雾干燥一种常见的湿法乳粉最常见加工过程之一，通过雾化液体物料蒸发水分来生产乳粉，热处理温相对较高可能导致蛋白质变性，但由于喷雾干燥通常发生在数秒内，产生的热损害相对有限[50]。一项经 130、160、190 ℃ 3 种不同喷雾干燥温度来探究的其对乳清蛋白变性率的研究发现，相对喷雾干燥前浓缩液的乳清蛋白变性率，3 种加工温度均未对乳清蛋白变性率产生显著性影响，尤其是β-Lg[51]。溶解性是乳清蛋白功能行为的一个重要性质，蛋白质变性及聚集是乳清蛋白溶解度降低的先决条件，进而也会影响牛乳的加工特性特性。另一项研究乳清蛋白经喷雾干燥后溶解度差异的研究表明，低出风温度(60～80 ℃)下的α-La 和β-Lg 溶解度没有显著影响，但在高出风温度(100～120 ℃)下，二者溶解度有显著下降，且β-Lg 的溶解度损失明显高于α-La[52]。此外，wang 等[53]也证实了与液态Lf 物料相比，喷雾干燥后制备的牛乳铁蛋白粉中粉体变性程度和构象变化可忽略不计。

3 结 论

乳生物活性物质种类丰富，功能特性诸多，目前已借助许多体外、体内实验证实其具有抗菌、抗炎、防治慢性疾病等潜在生理功能。根据既有报道，牛乳中丰富的活性物质作为潜在新型功能性原料，在婴儿配方奶粉等功能性乳制品和保健食品、口腔卫生制剂及慢性疾病防治药物中展现应用前景，但实际应用相对有限，值得进一步推进临床实验，深入探究乳活性物质在人体健康方面的应用价值。

相对于酪蛋白，牛乳中的乳清蛋白，尤其是β-Lg、α-La 对热处理方式更为敏感，可以作为热敏性指标来反推乳品加工强度和品质，衡量牛乳热处理强度的热敏性指标及乳制品质量安全评价指标需要进一步明确和完善。理想的牛乳热处理方式需要平衡好货架期和生物活性物质保留这两大因素，已有报道证实巴氏杀菌工艺活性蛋白热损相对较低，较为适宜，而近年来的报道指出了蒸汽注入式加工工艺在活性蛋白热损伤中展现出的优势，此外诸如超声波、微波处理等热替代性杀菌工艺的研究也有待进一步探讨和应用。