不同浓度七氟烷麻醉后对大鼠α4乙酰胆碱受体及认知功能的影响

曾晖 陈桂萍 林小龙 丘禄英 谢在斌 肖海荣

(福建中医药大学附属龙岩人民医院，福建 龙岩 364000)

七氟烷是一种优良的全身麻醉剂，无色无刺激，与其他常规全身麻醉剂相对比，具有不可燃、诱导期短、苏醒快、容易控制麻醉深度的特点，且毒副作用更小，已经作为新型的吸入型麻醉剂广泛运用于临床〔1〕。全身麻醉术后患者易发生术后认知功能障碍(POCD)，表现为记忆力、学习力、集中力的损害，严重者可引发痴呆，其发生机制尚不明确，目前认为与神经递质的改变相关，中枢神经递质及其受体的异常可导致认知功能的异常。有研究显示，不同年龄大鼠吸入七氟烷均可引起认知功能损害〔2，3〕，具体机制尚未阐明，本研究拟从中枢神经递质受体α4乙酰胆碱受体(α4-nAchR)的变化情况入手，探讨七氟烷对大鼠认知功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1动物、试剂与仪器 4月龄SD成年大鼠120只，雌雄各半，体重300 g左右(同济医科大学实验动物中心提供)；七氟烷(山东鲁南贝特制药有限公司)，Morris水迷宫试验(成都泰盟科技有限公司提供)，自动曝光仪(美国Bio-Rad)，时实荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)

1.2实验方法 120只大鼠随机分为对照(con)组、1%七氟烷(S1)组、2%七氟烷(S2)组、3%七氟烷(S3)组，麻醉前均进行5 d的Morris水迷宫定位航行训练，水迷宫为一圆形水池，分为四个象限，每个象限中点标记为大鼠入水点，第四象限上设置黑色平台，将平台置于水面下1 cm，每天训练4次，将大鼠分别从四个象限入水点面向池壁放入水中，限定大鼠2 min内找到平台并在平台上休息10 s，若未在规定时间内找到平台，则用木棒指引其找到平台并休息10 s，记录4次逃避潜伏期及总路程计算平均值。训练结束后开始麻醉，将大鼠放入80 cm×50 cm×20 cm的自制密闭透明容器中，容器有两个开口，一个连接麻醉机，另一个连接浓度监测仪，保持容器内麻醉药物在指定的浓度不变。对照组吸入空气，S1、S2、S3组分别吸入1%、2%、3%七氟烷，吸入时间均为2 h，麻醉结束后每组均分为三个亚组，即刻苏醒组(麻醉后2 h)、麻醉后24 h组及麻醉后72 h组，每个亚组各10只。

1.3观察指标 (1)认知力测试：在麻醉后各个时间节点对大鼠进行记忆力及认知功能测试，利用Morris水迷宫对大鼠进行定位航海测试及空间探索测试：撤去平台，将大鼠从原平台象限的右侧象限入水，游泳2 min，记录原平台象限滞留时间百分比、原平台象限运动距离百分比和原平台象限进入次数百分比。(2)大鼠海马体中α4-nAchR含量：在麻醉后各个时间节点用Western印迹法检测大鼠海马体α4-nAchR蛋白量：取大鼠一侧海马组织，匀浆、裂解、研磨，离心，取上清液，测定蛋白浓度，电泳分离、转膜、封闭，加入α4-nAchR单克隆抗体过夜后加入二抗，洗涤后于自动曝光仪中曝光，与内参 β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量；在麻醉后各个时间节点用RT-PCR法检测大鼠海马体α4-nAchR mRNA表达量：取大鼠一侧海马组织匀浆，加入1 ml Trizol 裂解，提取总RNA提取，根据沉淀物量加入无RNA酶水溶解 RNA，反转录cDNA，配制反应体系，加入相应引物，分析结果。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1麻醉前大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期与总路程 随着训练时间的推移，麻醉前大鼠逃避潜伏期与总路程逐渐缩短，各组间无统计学差异(P>0.05)，见表1、表2。

表1 麻醉前各组训练不同时间逃避潜伏期比较

表2 麻醉前各组训练不同时间总路程比较

2.2麻醉后各组逃避潜伏期与总路程 麻醉后S3组2 h、24 h、72 h及S1组2 h、24 h逃避潜伏期与总路程与对照组相比均显著延长；S2组2 h、24 h、72 h逃避潜伏期，2 h、24 h总路程与对照组相比均显著延长，除72 h逃避潜伏期外，S3组较S1、S2组延长更为显著(P<0.05)，见表3。

表3 麻醉后各组逃避潜伏期与总路程

2.3麻醉后各组空间探索能力对比 麻醉后S1组和S2组2 h、24 h，S3组2 h、24 h、72 h平台象限滞留时间、平台运动距离与对照组相比均显著缩短，S3组较S1组缩短更为显著(P<0.05)，见表4。

表4 麻醉后各组空间探索能力对比

2.4麻醉后各时间节点海马体α4-nAchR mRNA表达情况 麻醉后各时间节点大鼠海马体α4-nAchR蛋白与对照组相比均显著下降，S3组较S1组下降更为显著(P<0.05)，见表5、表6、图1。

表5 麻醉后各时间点海马体α4-nAchRmRNA表达

表6 麻醉后各时间点大鼠海马体α4-nAchR的蛋白表达

1：24-nAchR;2:β-actin图1 麻醉后各时间点海马体α4-nAchR蛋白表达

3 讨 论

认知功能是指大脑对外界信息进行加工处理并反馈的功能，包含了记忆、学习、表达等方面的内容，一旦出现认知功能障碍，患者可出现记忆能力、学习能力、语言表达能力、理解能力的下降或减退。诸多因素均可影响认知功能，手术全麻引起的认知功能障碍在临床上较为常见，有文献报道新型吸入麻醉剂七氟烷虽具有诱导期短、苏醒快等优点，但可引起苏醒后学习记忆和认知功能障碍〔4〕，常发生于术后3 d以内〔5〕，但发病机制尚未十分明确，电生理学研究显示，七氟烷可改变神经元功能〔6〕，诱导神经元凋亡，抑制新的神经元的产生〔7〕，促进淀粉样蛋白聚集，也可抑制乙酰胆碱受体电流〔8〕，4%的七氟烷引起的认知功能损伤可持续一个月之久。

海马体是大脑中有关于学习和记忆功能的高级神经活动中枢，可作为研究大脑学习和记忆力的理想模型〔9〕。海马组织中的乙酰胆碱是目前发现的与学习、记忆功功能关系最为密切的神经递质，有研究认为麻醉引起的认知功能障碍与烟碱型乙酰胆碱能受体的抑制相关。乙酰胆碱(Ach)是该主要通过毒蕈碱型(M)或烟碱型(N)受体发挥效应。N型乙酰胆碱能受体是由乙酰胆碱激活的阳离子选择性通道的配体门控通道受体，至今已确认有16种亚型，不同的亚型表现出不同的生理学特征。α4受体亚型是其中分布最多的受体亚型之一，广泛存在于海马体锥体神经元和中间神经元，当其受到抑制时，可出现遗忘症状。七氟烷引起的认知功能障碍可能与α4nAchR表达下降相关，Solt等〔10〕研究发现吸入麻醉药可以抑制α4神经型，使人产生遗忘作用而发生认知功能障碍，但这种抑制是可逆的，随着时间的推移，患者认知功能可逐渐恢复。Flood等〔11〕研究发现吸入低浓度的异氟烷可以抑制 α4 nAchR 的表达，罗思琴等〔12〕研究发现，吸入3%浓度的七氟烷可使大鼠海马体α7 nAchR 受体表达下降，引起认知功能障碍，也有研究认为七氟烷对成年及老年大鼠认知功能无影响〔13〕，目前有关于七氟烷对大鼠海马体中α4 nAchR 表达的影响鲜有报道，本研究从α4 nAchR 入手，探讨了七氟烷对大鼠认知功能的影响及机制。

在临床上，运用七氟烷的有效剂量为1.2～1.5 MAC，换算到大鼠，1 MAC约为2.4%浓度〔14〕，为了观察七氟烷对于大鼠认知功能的影响与吸入浓度的关系，本研究设置了1%、2%、3% 3个浓度组，对于大鼠认知功能的测定，选用了经典的Morris水迷宫测试，水迷宫测试包括了定位航行实验和空间探索实验，前者主要检测学习记忆力，后者则用来检测记忆提取能力，目前广泛运用于评价啮齿类动物的认知功能〔15〕。本研究结果显示吸入七氟烷后，大鼠学习记忆及提取能力均下降，且吸入浓度越高，影响越明显，但随着苏醒时间的延长，认知功能逐渐趋向恢复，提示七氟烷对大鼠认知功能影响是可恢复的。对海马体中α4 nAchR的研究发现，麻醉后各组大鼠α4 nAchR蛋白表达及mRNA表达均下降，吸入浓度越高，下降越明显。

综上所述，吸入七氟烷麻醉后可影响成年大鼠的认知功能，吸入浓度越高，认知功能障碍越明显，这种影响可能与大鼠吸入麻醉后海马体中α4 nAchR的表达下降相关。在将来的研究中，将进一步探讨相同浓度下吸入七氟烷不同时间后对大鼠认知功能的影响，并将从更多的神经递质及受体方面进行研究，深入探讨七氟烷对认知功能影响的作用机制。