PI3K信号通路在慢性阻塞性肺疾病大鼠气道及系统性炎症中的作用

陈忠仁 欧宗兴 王蕾 沈彬 梁海梅 杨绪莉 黄实仁

(中南大学湘雅医学院附属海口医院呼吸与危重症医学科，海南 海口 570208)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限持续存在为主要临床特征、异常的气道炎症为主要病理特征的慢性气道炎症性疾病。COPD特征之一就是系统性炎症〔1〕。 随着研究的深入，研究者不仅发现COPD患者在急性期存在系统性炎症，在稳定期系统性炎症也持续的存在〔2，3〕。但COPD的气道炎症是如何启动，通过何种途径引起血液中细胞因子级联瀑布反应而损害肺外器官引起并发症，目前尚无定论。本研究通过制备COPD大鼠模型，探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路在COPD大鼠气道炎症及系统性炎症中的作用。

1 材料与方法

1.1.1动物 健康清洁级 wistar 大鼠 36只，体重 220～250 g，由斯莱克提供。

1.1.2主要试剂 内毒素(Sigma)；LY294002(MCE)；转录试剂盒、预混液( TAKARA公司)；白细胞介素(IL)-18酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成)、IL-1β ELISA 试剂盒(南京建成)；红梅牌香烟(红塔集团)。

1.1.3主要仪器与设备 酶标仪(MK3)THERMO；荧光定量PCR仪(LightCycler®96)罗氏；正置显微镜(BK-FL2)重庆奥特光学仪器有限公司；烟熏染毒箱(自制)。

1.2动物模型的制备及分组 采用随机数字表法将 36 只 1 月龄健康清洁级Wistar 大鼠随机平均分为COPD组、干预组、空白组。COPD组和干预组依据宋一平〔4〕的方法造模。方法如下：第1天和第14天经气管滴入2 000 μl(质量浓度为 1 μg/μl)内毒素后2～30 d(第14天除外)，将大鼠放入5%香烟烟雾中熏0.5 h/d。干预组在每次烟熏前1 h，均予腹腔注射LY294002，剂量为1.5 mg/kg〔LY294002溶于二甲基亚砜(DMSO)，0.9%氯化钠注射液稀释至50 μl〕。而COPD 组和空白组在烟熏前腹腔注射等量的生理盐水。

1.3ELISA检测 采用双抗体两步夹心 ELISA 检测 IL-18、IL-1β 的水平，按试剂盒说明书操作，最后通过酶标仪和计算机得出细胞因子浓度 。

1.4Real-time PCR检测气道平滑肌细胞PI3K mRNA及血淋巴细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3 mRNA 取大鼠肺组织和血中淋巴细胞，加入 TRIzol 提取总RNA，逆转录合成 cDNA。将获得的 cDNA 按PCR试剂盒说明书方法扩增目的基因。引物β-actin正义链GGAGAAGATTTGGCACCACAC，β-actin反义链ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段长度173 bp。PI3K正义链CTGGAATGTGTGGCTGGAGT，PI3K反义链AGGAGGAGCGGTGGTCTAT，片段长度198 bp。NLRP3正义链AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，NLRP3反义链GAGCGTCACCACACACAGAT，片段长度179 bp。反应条件：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s共40～45个循环。计算Ct值，应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.5气道平滑肌细胞分离培养及鉴定 每组大鼠最后一次激发24 h内, 绑好大鼠，取肺放入烧杯，清洗肺部，用镊子将肺的内外膜除去，只剩下平滑肌。用眼科剪将肺部剪成 1～2 mm的小碎块。将碎块移入配好的消化液(含 1 mg/mlⅠ型胶原酶、1 mg/ml木瓜蛋白酶、10 mg/ml牛血清白蛋白的平衡盐溶液)中，放入培养箱中，消化15 min。取出，加入无血清的细胞培养液，约10 ml，移入离心管中。980 r/min，离心10 min。倒掉上清，加入约1 ml含20%胎牛血清的细胞培养液。将碎块用滴管加入25 ml的培养瓶里,置于37℃ 5% CO2培养箱中培养,每2～3 d换一次液,7 d左右细胞融合 80%后传代培养,实验用2～5代细胞。培养细胞通过形态学观察并经α-actin免疫荧光染色鉴定。

1.6苏木素-伊红染色显微镜下观察肺组织病理 制大鼠肺组织石蜡切片，后予二甲苯脱蜡，续用酒精水化，后1%伊红酒精染色，接着酒精梯度脱水，用二甲苯透明，最后封片，在显微镜下观察肺组织病理。

1.7统计学处理 使用GraphPad Prism6.0 和SPSS22.0 统计软件进行单因素方差分析、Pearson分析法。

2 结 果

2.13 组基本情况比较 空白组进食饮水正常，精神活跃，呼吸平顺，毛发洁白光泽，活动灵敏，反应迅速；而另外两组在造模过程中逐渐出现营养差，呼吸急促，反应迟钝，进食减少，皮毛枯槁发黄。

2.2气道平滑肌细胞(ASMCs)鉴定及肺组织病理 在显微镜下ASMCs有长突起，表现梭形，为典型“峰-谷状”生长；α-actin免疫荧光染色后为细胞质为棕黄色，呈阳性反应，鉴定培养的细胞为平滑肌细胞。光镜下可见COPD组支气管上皮增生增厚，管腔内大量炎症细胞浸润。见图1。

图1 ASMCs鉴定及肺组织病理

2.33组PI3K、NLRP3 mRNA及细胞因子水平分析 与空白组比较，COPD组IL-18、IL-1β及NLRP3、PI3K mRNA显著升高(P<0.05)；与COPD组比较，干预组以上指标均显著降低(P<0.05)。肺泡灌洗液中IL-18、IL-1β水平显著低于血清(P<0.05)。见表1。

表1 3组细胞因子及NLRP3、PI3K mRNA的表达

2.43组PI3K mRNA水平与细胞因子之间相关性分析 PI3K mRNA水平与血清IL-18(r=0.805)、 IL-1β(r=0.757)水平呈显著正相关(P<0.05)。

3 讨 论

COPD最可能的机制就是气道炎症的外溢机制〔5〕。近来，随着人们对炎性小体认识的加深，它在COPD中发生、发展的作用逐渐被人认识到。炎症小体是一种多蛋白复合物，分布于细胞质中，可以被多种病原相关分子模式(PAMP)和危险相关分子模式(DAMP)激活〔6〕。COPD患者中的病原体相关分子及氧化应激分子可以激活炎性小体，而激活的炎性小体可招募并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水平解酶(caspase)-1，剪切IL-1和IL-18前体，产生相应的成熟细胞因子发挥生物学作用〔7〕。

PI3K属于脂质激酶的家族，可使肌醇环第3位羧基磷酸化为磷脂酰肌醇激酶，具有蛋白激酶和类脂激酶双重活性。PI3K是caspase-1激活的最为公认的上游机制〔8，9〕。有研究指出，可通过抑制PI3K磷酸化来减少NLRP3表达。

研究发现，NLRP3炎症小体及细胞因子IL-18和IL-1β参与了COPD的发病〔10〕。IL-1β是由单核巨噬细胞分泌的细胞因子，可发挥炎症反应、免疫应答的生物学作用。有研究发现，IL-1β能够增加肺部多种细胞因子和细胞间黏附分子(ICAM)-1、血管细胞黏附分子(VCAM)-1、E-选择素的水平，致使嗜酸粒细胞和中性粒细胞发生炎症募集并浸润到支气管黏膜〔11〕。IL-18主要由巨噬细胞产生，在促进炎症发生及对外来致病源免疫中起着重要的作用。陈庆芸等〔12〕研究发现，IL-18可能跟COPD的气道炎症、系统炎症和营养状态的变化相关。

本研究表明LY294002能有效抑制PI3K的活性。通过制造COPD模型刺激了PI3K信号通路后，其下游的细胞因子如IL-1β、IL-18也得到激活、成熟、发挥生物作用，参与了肺组织的慢性炎症过程。干预组的PI3K表达虽得到抑制，但肺泡灌洗液的细胞因子表达仍显著高于空白组，说明细胞因子活化后，有自身的正反馈机制，不完全被上游信号抑制，这也可以解释为何COPD稳定期患者气道炎症仍持续存在〔13，14〕。

本研究结果表明NLRP3 mRNA在各组大鼠的表达与PI3K一致，提示NLRP3作为PI3K的下游信号因子，抑制PI3K的表达可有效抑制NLRP3的活化这与Qiao等〔15〕的研究相符合。与大多数的研究所指出的一样〔16〕，NLRP3炎性小体的活化可以使无活性的细胞因子前体产生为有生物学作用的细胞因子，在全身系统中持续产生炎症作用。

研究表明 COPD 的炎症反应不仅仅局限于肺部，而且存在全身的系统性炎症。COPD 稳定期患者同样存在着系统性炎症，只是细胞因子的浓度较急性加重期低。因此系统性炎症是 COPD 的主要特征之一〔1〕，这也是 COPD 呈进行性发展及存在并发症的原因之一。 本研究发现，COPD作为一个以慢性气道炎症为特征的呼吸系统疾病，其血清的细胞因子表达，在3组大鼠中均高于肺泡灌洗液，提示气道细胞因子外溢后，可能激活NLRP3及血清的细胞因子，产生级联放大效应，诱发和维持肺外炎症。本研究结果表明PI3K信号通路的激活，不仅可以活化肺部的炎症，肺外炎症一样有促进作用；PI3K信号通路对肺外细胞因子的激活，使其发挥生物学作用，也可能是系统性炎症产生及持续存在的原因。

综上所述，抑制PI3K的表达，可以有效减少NLPR3、IL-1β、IL-18的活化，减轻COPD气道炎症及肺外炎症，为防治COPD及并发症提供新思路及新的治疗位点。