延龄草甾体皂苷类成分对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用

陈林林 李中炼 万登峰 曹文锋 左月明 张忠立

(江西中医药大学 1药学院，江西 南昌 330004；2实验动物科技中心；3江西省人民医院)

延龄草是传统名贵中药，也是恩施土家族民间药之一〔1〕，其味甘、性平、有小毒，具有延年益寿的功效，主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、脑震荡后遗症等疾病〔2〕。现代药理研究具有抗氧化、抗衰老、降血压、抗炎镇痛、调节免疫等作用〔3，4〕。有研究发现，头顶一颗珠中提取的总甾体皂苷可减轻中动脉栓塞致局灶性脑缺血大鼠组织损伤，改善神经病理学及神经血管单元微结构改变，增加缺血脑区血流灌注，促进神经功能的重塑〔5〕。本研究组前期通过改良Zea Longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)损伤模型，研究证实延龄草抗脑I/R损伤的有效部位为85%乙醇洗脱物，并从中分离得到指标性和特征性4个甾体皂苷类单体化合物。本研究探讨延龄草中4个甾体皂苷类单体成分抗脑I/R损伤作用机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD雄性大鼠96只，体重240～280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证编号为SCXK(湘)2016-0002。

1.2药物及试剂 偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y2T组)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y3T组)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y4T组)、偏诺皂苷元(YP组)均由本实验室自行制备(纯度均大于98%)；尼莫地平片(Lot170107)购于亚宝药业集团股份有限公司；银杏叶片(Lot 20170320)购于南京易亨制药有限公司。

1.3主要仪器 Thermo D-37520台式高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；UV8100紫外-可见分光光度计(美国莱伯泰科有限公司)；RM2255切片机(德国Leica公司)；ELX800酶标仪(Bio Tek公司)；BX43三目Olympus显微镜(上海三崴医疗设备有限公司)。

1.4方法

1.4.1分组及给药 SD大鼠随机分为12组：假手术组(Sham组)，模型组(I/R组)，尼莫地平片组10 mg/kg(Contrast 1组)，银杏叶片组60 mg/kg(Contrast 2组)，Y2T中剂量组60 mg/kg(Y2TM组)，Y2T高剂量组90 mg/kg(Y2TH组)，Y3T中剂量组60 mg/kg(Y3TM组)，Y3T高剂量组90 mg/kg(Y3TH组)，Y4T中剂量组60 mg/kg(Y4TM组)，Y4T高剂量组90 mg/kg(Y4TH组)，偏诺皂苷元中剂量组37 mg/kg(YPM组)，偏诺皂苷元高剂量组54 mg/kg(YPH组)，连续灌胃给药8 d，第8天灌胃1 h后，制备脑I/R模型。Sham组和I/R组用蒸馏水灌胃。

1.4.2造模 末次给药1 h后，应用改良Zea Longa线栓法建立大脑中动脉阻塞法(MCAO)制备局灶性脑I/R模型〔6，7〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，颈中部纵向切开皮肤2 cm，钝性分离皮下组织与肌肉，暴露右侧颈总动脉(CCA)，小心剪开包裹CCA及迷走神经的鞘膜，并继续分离右颈内动脉(ICA)及右颈外动脉(ECA)。在CCA 近心端、远心端分别穿线，近心端系紧，结扎CCA，远心端系一松结备用。分离ECA、ICA，并在ECA穿线结扎，用动脉夹夹闭ICA。距CCA分叉处约4 mm剪一“V”形小口，插入栓线，用备用的丝线打一正结，松开ICA 的动脉夹，然后调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，轻轻将线栓送入颅内，轻缓推进直至感觉到阻力，插入深度在18.0～20.0 mm，即完成了大脑中动脉阻塞所致大脑局灶性脑缺血的制备。分层缝合肌肉与皮肤(部分栓线留体外)。于2 h 后轻轻地向外拔出栓线1 cm左右至略感阻力即可进行再灌注4 h，剪断皮肤外露的栓线。Sham组不插入线栓，其余同I/R组。

1.5指标测定

1.5.1一般情况观察 实验过程中每天观察并记录饮食、饮水情况及精神状态。

1.5.2神经功能评分 参照Zea Longa 5分制评分标准对大鼠神经功能进行盲评：0分：没有神经功能缺损；1分：对侧前爪不能完全伸展，为对侧前肢内收、屈曲；2分：行走时大鼠向对侧转圈、划圈，将大鼠置于地面时，推动患侧肩向对侧移动时，阻力明显降低；3分：行走时大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒；4分：意识丧失，不能自发行走；5分：死亡。评分在1～3者，确定大鼠造模成功，纳入I/R组。

1.5.3大鼠脑指数的测定 脑I/R评分后，大鼠麻醉，取出全脑，生理盐水冲洗，去除嗅球、小脑及脑干，滤纸吸干水分，称重。脑指数=脑湿重(g)/体重(100 g)，可反映血脑屏障结构损伤的情况。

1.5.4大鼠脑梗死体积的测定 将脑组织称重后，立即放置-20℃冰箱中快速冷冻20 min，用手术刀片由前向后行冠状位切片，共5片，每片约 2 mm厚，置 2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃避光染色30 min，15 min后翻面。经染色正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死区呈苍白色，界限清晰。染色后再用4%多聚甲醛固定30 min，拍照，采用Image Pro Plus6.0医学图像分析系统对脑梗灶体积进行分析，使用计数与测量工具计算梗死区体积及占整个脑体积的比例。

1.5.5大鼠脑组织病理形态学和血清生化指标的测定 大鼠行心脏采血，离心后取血清，测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷氨酸、一氧化氮(NO)和Ca2+的含量；部分大鼠取脑组织，测定大鼠脑组织炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，观察海马CA1区和皮质层病理学改变。

1.6统计方法 采用SPSS13.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠神经功能评分的影响 Sham组无神经功能缺损，I/R组神经功能缺损明显；Contrast 1组、Contrast 2组、Y2TM组、Y2TH组、Y3TH组、Y3TM组、YPM组、T4TH组神经功能缺损评分均明显低于I/R组(P<0.05，P<0.01)。YPH组、Y4TM组神经功能缺损与I/R组无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠脑指数的影响 I/R组大鼠脑指数明显高于Sham组，Contrast 2组、Y2TM组、Y3TM组、Y3TH组、Y4TM组及Y4TH组大鼠脑指数均明显低于I/R组(P<0.05，P<0.01)；其余各组大鼠脑指数改善不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3延龄草甾体皂苷单体对I/R损伤大鼠脑梗死体积的影响 TTC染色结果显示(正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈苍白色，界限清晰)，Sham组未见梗死灶，I/R组出现明显梗死灶。Contrast 1组、Contrast 2组、Y2TH组、Y2TM组、Y3TH组、Y3TM组、Y4TM组、Y4TH组、YPM组、YPH组梗死灶体积明显小于I/R组(P<0.01，P<0.05)。见表1，图1。

表1 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠神经功能缺损评分、脑指数及脑梗死体积的影响分)

图1 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠脑梗死TTC染色结果

2.4延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影响 I/R组血清SOD活性明显低于Sham组，MDA和谷氨酸含量明显高于Sham组(均P<0.01)；与I/R组比较，Contrast 1组、Contrast 2组、Y2TM组、Y2TH组、Y3TM组、Y3TH组、Y4TM组、Y4TH组、YPM组、YPH组均能使血清SOD活性升高，而使MDA和谷氨酸含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影响

2.5延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠血清NO、Ca2+含量的影响 与Sham组相比，I/R组大鼠血清中NO和Ca2+含量明显升高(P<0.01)；与I/R组比较，Contrast 1组、Contrast 2组、Y2TM组、Y2TH组、Y3TM组、Y3TH组、Y4TM组、Y4TH组、YPM组、YPH组均能使血清NO和Ca2+含量显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠血清NO和Ca2+含量的影响

2.6延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠脑组织海马区和皮质层区病理损伤的影响 常规苏木素-伊红(HE)染色，观察脑缺血病理学变化，Sham组大鼠海马区和皮质层区神经元及胶质细胞排列整齐，结构正常。I/R组大鼠海马区和皮质层区神经细胞排列紊乱，细胞形态不完整、肿胀，大量神经元丢失、死亡，部分细胞核溶解、固缩。各给药组(尤其是Y2TH组、Y3TH组、Y4TH组)大鼠脑组织海马区和皮质层区神经元数量增多，排列较整齐，细胞结构接近正常，核固缩、坏死明显减少，说明各给药组对脑I/R损伤的神经细胞损伤均有显著改善和保护作用。见图2。

图2 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠海马及皮质层区病理学变化(HE，×400)

2.7延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠脑组织IL-6、IL-1β、TNF-α的影响 在进行脑I/R损伤造模后，与Sham组比较，I/R组脑组织IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显升高(P<0.01)；与I/R组比较，各给药组脑组织IL-6、IL-1β和TNF-α含量均显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表4。

表4 延龄草甾体皂苷单体对脑I/R损伤大鼠脑组织IL-6、IL-β和TNF-α含量的影响

3 讨 论

脑I/R损伤的病理生理机制极为复杂，主要与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等有关，同时伴有神经功能受损、学习记忆障碍和脑梗死灶形成等〔8〕。祖国传统医药在治疗缺血性脑血管病方面有较大潜力，尤其是中药单体的生物活性研究得到广泛开展。已有研究证实延龄草总甾体皂苷具有改善脑I/R损伤的药理作用〔5〕。

线栓法制备MCAO动物模型具有不开颅、效果可靠，能准确地控制缺血及再灌注时间，对动物自身的生理功能损伤小、术后生存率高等特点。神经功能评分是评价治疗脑缺血药物疗效的一项指标，可从运动功能的角度评价脑I/R损伤的程度〔9〕。TTC染色法常用于评估组织的梗死体积〔10〕。本研究结果提示，延龄草中4个甾体皂苷类单体成分均能显著降低脑I/R大鼠翻正反射恢复时间、减轻I/R部位的病理损伤，降低脑组织含水量、减少脑梗死体积，减缓脑组织的损伤。

氧化应激是指机体中活性氧(ROS)产生过多或者清除能力下降，氧化系统和抗氧化系统的平衡一旦受到破坏，会导致机体发生潜在的病理性损伤〔11〕。研究发现〔12〕，脑I/R损伤时，机体可产生大量ROS，这些ROS不能被内源性的抗氧化系统及时清除，导致DNA氧化，引起膜脂质过氧化反应等一系列的连锁反应。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，可以改变细胞膜的通透性和流动性，是研究抗氧化能力的常用指标。SOD是自由基清除剂，是对抗ROS过多产生的两种主要酶，其活力能够间接反映机体清除氧自由基的能力〔13〕。脑缺血后引起突触末梢谷氨酸释放，激活突触后膜亲离子受体，导致膜去极化，膜兴奋性增高，阳离子通道开放，引起Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，启动一系列酶引起细胞损伤，其中活化的一氧化氮合酶可催化产生过量NO，与超氧阴离子形成过氧亚硝酸根离子和羟基，损伤线粒体膜，致使离子平衡紊乱〔14〕，引起神经元的损伤。本研究提示延龄草中4个甾体皂苷类单体成分能明显升高MCAO大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，抑制谷氨酸的合成和分泌，减少NO和Ca2+的释放，来减弱机体的氧化损伤程度，增加机体的抗氧化应激能力，减少神经元的损伤。

促炎性细胞因子是中枢神经系统疾病中的重要炎性介质。脑缺血可刺激内皮细胞和白细胞中黏附分子的表达，产生大量的促炎性细胞因子，从而导致白细胞的黏附及向大脑软组织外渗〔15〕。本研究结果表明延龄草中4个甾体皂苷类单体成分能使MCAO大鼠抑制激活小胶质细胞释放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等多种炎症因子，提示其对脑I/R损伤的保护作用与其抗炎作用有关。