宫颈分泌物检测HPV基因型对老年宫颈癌癌前病变的筛查效果

刘芳林 路影 李飞飞 刘涛 (阜阳市第二人民医院 妇科，安徽 阜阳 3605；病理科)

宫颈癌是世界第四大最常见的女性恶性肿瘤，而在经济欠发达国家，宫颈癌的发病率与死亡率更高〔1〕。在我国宫颈癌发病位居女性恶性肿瘤第二位，且还在逐年攀升，其发病风险与年龄相关，65岁以上患者占宫颈癌死亡患者的40%以上〔2，3〕。人乳头瘤病毒(HPV)是与宫颈癌高度相关的病原体，其感染是宫颈癌的主要危险因素〔4〕。特别是高风险HPV的基因型(16、18、30和31)与导致癌前病变和癌变的上皮细胞改变直接相关〔5〕。宫颈分泌物涂片检查是一种简便非侵入性HPV筛查方法，现在已和薄层液基层细胞检测技术(TCT)一起作为妇科常规检查技术〔6〕。目前关于宫颈分泌物HPV基因型与老年宫颈癌患者癌前病变的关系的研究仍很局限。本研究旨在评估宫颈分泌物检测高危型HPV基因型对宫颈上皮内瘤变(CIN)的筛查效果。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2017年2月1日至2019年2月29日在阜阳市第二人民医院妇科行门诊阴道镜的65岁以上患者110例，均接受宫颈细胞学涂片及HPV基因型检测。平均年龄(71.6±6.1)岁，平均体重指数(BMI)(22.7±3.8)kg/m2。排除既往宫颈癌病史、已接受全子宫切除术、精神疾病史者。所有患者签署知情同意书并报医院伦理委员会批准。

1.2宫颈细胞涂片检查 置入阴道窥器完全暴露宫颈包括宫颈外口和鳞状及柱状上皮交界处。使用细胞刮刀在子宫颈上单向旋转360°，再将细胞刷置于宫颈内并单向旋转180°。将宫颈分泌物样品涂在载玻片上，并用喷雾固定剂固定。然后将样品送到病理科进行细胞学检查。发现阳性结果包括意义不明的非典型细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)或高度鳞状上皮内病变(HSIL)的患者进一步接受阴道镜检查和阴道镜引导病理活检〔7〕。

1.3HPV基因型检测 首先使用AmpliLute液体培养基提取及HPV linear array分型试剂盒(购自罗氏诊断产品(上海)有限公司)从宫颈分泌物中提取DNA。提取的DNA立即保存在-20℃环境下。然后使用正向(5′-ACACAA CTGTGTTCACTAGC-3′)和反向(5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′)引物对β-珠蛋白基因的268个碱基对片段进行PCR扩增评估DNA样品的完整性。并使用正向(5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′)和反向(5′-AAAAAT AAACTGTAAATCATATTC-3′)引物对β-珠蛋白阳性样品HPV L1开放阅读框的450个碱基对片段继续进行PCR扩增。每次反应均包括HPV阳性和HPV阴性对照。最后在含溴化乙锭(0.5 mg/ml)的2%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察扩增的PCR产物〔8〕。HPV linear array用于对HPV进行基因分型，可分为与宫颈癌高度相关的高风险型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82，HR-HPV )和与其他低风险型(LR-HPV)〔9〕。

1.4统计方法 应用SPSS22.0 软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1基线资料 患者宫颈涂片HSIL、LSIL、ASCUS及炎性细胞比例分别为13例(11.8%)、14例(12.7%)、20例(18.2%)、63例(57.3%)；HPV分型高危型、低危型及阴性比例分别为36例(32.7%)、21例(19.1%)、53例(48.2%)，其中高危型及低危型为本研究对象，纳入后续研究；共47例接受了病理活检，包括HPV高危型及低危型43例，其中CIN 3、CIN 2、CIN 1及慢性炎症比例分别为25.5%、21.3%、12.8%、40.4%及HPV阴性4例(不计入后续研究)。

2.2HR-HPV及LR-HPV组临床资料比较 两组年龄、BMI及宫颈涂片结果均无统计学差异(P>0.05)，HR-HPV组高级别CIN(CIN 2+CIN 3)患者比例高于LR-HPV组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3HPV分型对病理活检CIN的诊断价值 HPV分型对诊断CIN的灵敏度、特异度、符合率、kappa值及正确指数分别为82.1%、92.7%、90.0%、74.0%、0.75；HPV分型对诊断高级别CIN的灵敏度、特异度、符合率、kappa值及正确指数分别为81.8%、87.5%、86.4%、61.9%、0.69。

2.4HPV分型与细胞学检测并联试验对病理活检CIN的诊断价值 并联试验对诊断CIN的灵敏度、特异度、符合率、kappa值及正确指数分别为100.0%、76.8%、82.7%、62.8%、0.77；对诊断高级别CIN分别为100.0%、77.3%、77.3%、50.2%、0.72。见表1。

表1 HR-HPV与LR-HPV组临床资料比较〔n(%)〕

3 讨 论

全球83%的宫颈癌发生在发展中国家，2015年我国有近10万宫颈癌新发病例与3万死亡病例〔10〕。早预防、早发现、早治疗是降低发病率和死亡率的关键。宫颈癌的发展是一个渐进过程，需要10年以上才能从不典型增生发展成浸润性宫颈癌，老年患者无论宫颈癌或其癌前病变的患病率及其进展速度都要高于年轻患者〔11，12〕。HPV持续感染是宫颈癌最重要的危险因素，高危型HPV与宫颈癌密切相关，老年妇女的HPV感染率也高于年轻妇女〔13,14〕，因此对HPV进行分型对于老年宫颈癌的预防有重大意义。根据2010年进行的一项全球回顾性横断面研究，浸润性宫颈癌HPV基因型前8位分别是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52和HPV58〔15〕。本研究总HPV感染率为51.8%，最常见的基因型为HPV16、HPV18和HPV58。宫颈细胞学检查也是宫颈癌筛查的主要手段，细胞学阳性患者应接受阴道镜检查〔16〕，本研究结果显示对HPV基因分型由此指导患者病理活检的重要性与日俱增。

在病理活检CIN 2级以上患者中，HR-HPV比例为81.8%，可见HPV分型与病理活检阳性有较好的相关性，此外，HSIL、LSIL及ASCUS细胞中各有患者HPV检测呈阴性，病理活检提示均为慢性炎症，说明HPV分型可能更有助于提高细胞学检测的特异度，本研究发现HPV分型对于CIN的灵敏度与特异度较好，符合率达90%，说明HPV高危型与病理活检CIN之间有较高的一致性，与前人研究一致〔17,18〕。kappa值及正确指数为74%和0.75，这可能是由于高危HPV也分为多种基因型造成的诊断结果可重复性不佳的缘故，后续研究需要进一步对高危HPV进行细分以提高kappa值及正确指数。当下CIN 1级患者可以保守观察，约60%的患者可自行消退，但CIN 2级以上病变属于宫颈癌癌前病变，需要积极处理〔19〕，本研究显示HPV分型对CIN 2级以上病变的诊断价值，其灵敏度及特异度也在80%以上。鉴于宫颈细胞学检查现已广泛用于宫颈癌筛查，我们将HPV分型与细胞学检查进行并联诊断〔20〕，合并后对于诊断CIN及高级别CIN的灵敏度达到了100%，显著增加了宫颈癌癌前病变的筛查效能。

本研究尚存在一些不足：(1)本研究未对高危HPV基因型进行进一步分型，导致诊断试验可重复性及正确指数稍显不足，需要后续研究加以补充；(2)本研究样本量还需进一步扩大以明确HPV分型及细胞学试验的筛查效能；(3)后续还应进一步观察高危型HPV在宫颈癌前病变基础上与宫颈癌发生的关联，已明确其危险程度及其与年轻患者的对比，以便在临床工作中深化对于老年患者的HPV筛查及宫颈癌防治。

综上，宫颈分泌物检测HPV基因型对于发现高危HPV基因型感染并联合细胞学试验筛查老年宫颈癌癌前病变有较好的诊断效能。