CO2气腹对结直肠癌细胞HT-29增殖侵袭能力的影响

雷 宇 陈永军 黄 俊 赵 波 蔡小勇

(广西医科大学第二附属医院普通外科，广西南宁市 530007)

1991年Jacobs等成功实施了世界首例腹腔镜乙状结肠切除术[1]，随着腹腔镜技术和设备的不断发展，腹腔镜结直肠癌切除术的应用亦越来越广泛，然而腹腔镜手术是否增加恶性肿瘤的侵袭能力仍存在争议[2]。有研究显示，腹腔镜手术所需的气腹不仅改变了腹腔的原有压力，同时高浓度CO2也改变了结直肠癌细胞原有的生存环境，提高了肿瘤增殖转移的能力，同时气腹介质是导致癌细胞经trocar切口转移的重要因素，CO2可增加癌细胞经trocar切口转移的风险，而氦气可减少癌细胞经trocar切口的转移[3-4]。本研究通过模拟腹腔镜CO2气腹环境，探讨CO2气腹的压力与结直肠癌细胞HT-29生长及侵袭能力的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 肠癌细胞株的选择：选取人结直肠癌细胞株HT-29，放置在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，置入37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养，48 h换液1次，换液均在弱光条件下进行操作，取对数生长期细胞进行实验。单克隆抗体的选择：鼠抗人E-cadherin单克隆抗体及通用型二抗，购于长岛公司。实验动物的选择：择取6～7周龄雌性裸鼠60只，体重(20±2)g，购于上海市肿瘤研究所实验动物部。将60只裸鼠按随机化原则分为0 mmHg组、5 mmHg组、10 mmHg组和15 mmHg组4组，每组15只。

1.2 方法

1.2.1 结直肠癌细胞HT-29培养液pH值 取对数生长期的结直肠癌细胞HT-29，用PBS缓冲液漂洗，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，重悬后制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别取1.0 mL加入24孔培养板中，置于5 mmHg、10 mmHg、15 mmHg的压力箱中，维持孵育时间3 h后排气，继续放在与0 mmHg组相同的环境中(37 ℃、5% CO2饱和湿度)培养。分别于处置前和处置后0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h取各组培养液用电子pH计测定pH值。

1.2.2 免疫组织化学检测 按上述方法取对数生长期结直肠癌细胞HT-29分别在0 mmHg、5 mmHg、10 mmHg、15 mmHg CO2气腹压力下作用3 h，然后置于细胞培养箱培养48 h，结直肠癌细胞株通过高速离心、涂片、固定，然后以苏木素染色检测E-cadherin水平。

1.2.3 裸鼠气腹模型的建立 各组裸鼠腹部皮肤均用0.3%碘伏消毒，1 mL皮试针头腹腔内接种结直肠癌细胞HT-29悬液0.2 mL，每只裸鼠注射细胞量约为5×105个，选用浓度为99.5%的医用CO2建立气腹。将HT-29细胞株分为4组，分别于5 mmHg、10 mmHg及15 mmHg CO2气腹中及免气腹(5% CO2、37 ℃)孵育，均维持1 h。实验完毕，各组裸鼠腹腔注射4 000 U/mL青霉素稀释液0.2 mL抗感染。给予标准实验室食物、自由饮水，所有裸鼠每周称重，观察裸鼠精神、觅食情况及腹壁肿瘤出现时间和肿瘤大小。30 d后，用颈椎脱臼法处死小鼠。

1.3 观察指标 处死后的裸鼠纵行剖开腹腔，观察成瘤裸鼠腹腔内肿瘤结节数量(直径>1 mm纳入计数)，剖检腹腔后，见腹腔内无明显腹水，依次查找腹腔器官。发现肿瘤组织后尽量完整分离，去除周围结缔组织，称重比较各组瘤体的平均重量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，不同时间点的数据用重复测量资料的方差分析；计数资料用例数和百分率[n(%)]表示，组间比较用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同CO2气压环境对结直肠癌细胞HT-29培养液pH值的影响 处理前，各组培养液pH值差异无统计学意义(P>0.05)。处理后0 h、0.5 h、1 h，5 mmHg组、10 mmHg组、15 mmHg组细胞培养液pH值均低于0 mmHg组(均P<0.05)；处理后2 h，10 mmHg组、15 mmHg组pH值低于0 mmHg组和5 mmHg组(P<0.05)，而0 mmHg组和5 mmHg组pH值差异无统计学意义(P>0.05)；处理后3 h，15 mmHg组pH值明显低于0 mmHg组(P<0.05)，其余各组pH值两两比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组结直肠癌细胞HT-29培养液pH值比较 (x±s)

2.2 裸鼠腹腔内肿瘤增殖情况 腹腔内肿瘤生长情况显示肿瘤结节最易生长部位为腹壁的壁腹膜。随着气腹压力增高，肿瘤种植数量明显增多，肿瘤质量显著增大，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组裸鼠腹腔内肿瘤增殖情况比较

2.3 不同CO2气腹压力对结直肠癌组织中E-cadherin表达的影响 各组E-cadherin阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组裸鼠结直肠癌细胞株HT-29在不同气腹压力下E-cadherin表达情况

3 讨 论

腹腔是由脏壁腹膜包绕的一个密闭腔隙，pH值为弱碱性。在腹腔镜结直肠癌手术中我们使用干燥、高浓度、温度为21 ℃的CO2气体注入腹腔制造气腹后会导致一系列微环境的改变。气腹会导致腹膜间皮细胞损伤及炎症反应的发生，同时会增加脱落肿瘤细胞黏附和扩散的机会[5]。CO2气体有组织低溶性、血液高溶性的物理特征，容易改变微环境的酸碱度，对细胞的生理代谢功能有干扰作用。Kuntz等[6]研究认为酸性环境中，腹腔内局部血供减少同时增加了血管通透性，可能CO2气腹由此促进恶性肿瘤细胞生长与种植[6]。我们构建的体外模拟腹腔镜在不同CO2气腹压力下暴露3 h，发现处置后0 h、0.5 h、1 h，5 mmHg组、10 mmHg组、15mmHg组结直肠癌细胞株HT-29细胞培养液pH值与0 mmHg组相比下降明显，而且气腹压力越大其值下降越明显。可能是由于在模拟较高压力且高浓度医用CO2气腹环境下，CO2溶解度增加，导致细胞培养液中的碳酸含量增加、pH值下降 。因此，体外模拟不同CO2气腹压力环境对细胞培养液pH值有明显的影响，这种pH的改变可能打破了肿瘤细胞局部微环境、干扰了腹腔局部微环境抗肿瘤能力，从而促进肿瘤的增殖生长。

CO2气腹是否会促进恶性肿瘤细胞的增殖及生长，从而影响手术疗效一直是学术界争论的问题之一。正常细胞的增殖生长依赖于生长因子的调节，然而恶性肿瘤往往生长速度快、保持高代谢状态，其本身存在对缺血缺氧调节与适应的能力，进而诱导肿瘤细胞内多种细胞因子的表达，促进血管生成，从而促进肿瘤的增殖及生长。有研究认为CO2气腹具有促进恶性肿瘤增殖的作用，Lee等[7]通过小鼠模型发现，模拟腹腔镜气腹组肿瘤细胞的增殖指数明显高于空气对照组，认为CO2能刺激肿瘤细胞生长，CO2气腹在恶性肿瘤手术的应用中存在安全隐患。缺氧诱导因子-1α可以介导组织细胞对缺氧的适应，同时还能调控血管内皮生长因子等相关肿瘤基因的表达，在CO2气腹下缺氧诱导因子-1α表现明显升高，继而促进肿瘤的增殖生长[8]。Takiguchi等[9]研究认为CO2气腹对肿瘤细胞有毒性作用并不提升其增殖分裂的能力。Lin等[10]也通过模拟腹腔镜手术环境暴露人卵巢癌细胞株Hela细胞的研究，认为CO2气腹能抑制卵巢癌细胞的增殖和生长。Cai等[11]通过体外实验认为湿润的CO2可以减少结直肠癌的腹腔种植——归因于气腹作用下pH值的改变、缺氧及CO2气体的物理特性对肿瘤细胞生长存在抑制作用。由此可知，CO2气腹对肿瘤细胞的影响机制极为复杂。本研究结果显示，随着CO2气腹压力升高，腹腔内种植的肿瘤质量增大，腹腔内种植转移灶数目增多(均P<0.05)。尤其在15 mmHg气腹组中，其对肿瘤生长增殖的影响最大，术后腹腔内肿瘤平均质量最大。本研究结果提示，气腹压力的大小对肿瘤生长具有一定影响。在模拟不同腹腔镜气腹压力下，肿瘤腹壁种植远高于其他种植方式，可能是由于腹膜间皮细胞的改变及腹腔内理化环境的改变等，在一定程度上促进肿瘤细胞的腹膜种植转移。以上研究提示，行腹腔镜手术时应注意控制气腹压力不宜过高，以减少恶性肿瘤术后生长和种植转移机会，然而CO2气腹对恶性肿瘤增殖的影响程度及具体机制还有待进一步深入研究。

腹腔镜结直肠癌手术目前虽已广泛应用于临床，然而腹腔镜手术是否增加癌细胞侵袭能力仍是基础研究中有争议的问题之一[12]，E-cadherin在细胞与组织构架中起着信息黏附等至关重要的作用，它的异常表达或功能缺失可导致细胞的转化和加速肿瘤进展。有学者在结直肠癌和胃癌的研究中发现E-cadherin发生突变导致肿瘤的侵袭转移[13]。 E-cadherin通过与α/β/λ-cadherin相互连接使结直肠癌细胞相互黏附，E-cadherin出现破坏或缺失可导致恶性肿瘤细胞的转移，增加了癌细胞的侵袭能力，然而研究证明E-cadherin须在细胞膜上才能发挥其黏附作用。Leister等[14]通过小鼠和结直肠癌细胞株HT116构建腹腔镜手术模型，发现E-cadherin通常在正常细胞中表达稳定，然而在癌细胞株中表达不稳定，常导致肿瘤细胞容易脱落导致侵袭性转移，然而气腹可以抑制β-cadherin的表达，减少结直肠癌细胞侵袭转移。本研究中不同气腹压力下E-cadherin表达率差异无统计学意义(P>0.05)，研究结果支持高浓度医用CO2气体介质及不同的气腹压力对E-cadherin的表达影响不明显，环境的改变可能并不增加结直肠癌细胞的侵袭性。

综上所述，腹腔镜CO2气腹改变了腹腔的微环境： 局部血管通透性的改变、酸碱度的变化及腹膜间皮细胞的破坏。这些改变可能增加结直肠癌细胞在腹腔内增殖生长的能力，然而对结直肠癌细胞的侵袭性影响不明显。我们在临床应用中发现腹腔镜结直肠癌手术，尤其是直肠癌手术中有着空间大、视野清晰等较明显的优点，随着新辅助放化疗的实施和腹腔镜技术及设备的不断更新改进，腹腔镜结直肠癌手术的潜在风险会得到很好的控制，有更广的应用前景。