轻中度肝纤维化大鼠肝脏3.0 T MR表观扩散系数与基质金属蛋白酶-1表达的相关性研究

2020-12-09王松海邱丽莉罗毓媛张凯航

内蒙古医科大学学报 2020年6期

范龙，王松海，邱丽莉，罗毓媛，张凯航

（1.海南医学院第二附属医院放射科，海南海口 570311；2.海口市中医医院放射科）

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）[1，2]的逐渐沉积是导致肝纤维化进展的重要途径，而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可特异性降解ECM。MMPs家族中基质金属蛋白酶-1（matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）广泛存在于人体中[1，2]，被肝细胞、枯否氏细胞等分泌，是组织肝纤维化进展的主要蛋白酶原[3，4]。MMP-1在肝组织中的表达也可以客观反映肝纤维化病理程度。

美国肝脏疾病研究协会指南上[5]提出F2期肝纤维化对临床治疗选择上具有重要的意义。Ronot[6]等研究结果也支持中度肝纤维化是影响慢性肝病预后的重要一步。MRI-DWI目前已经是较成熟的功能成像技术[7～10]，ADC值可在体量化评估肝纤维化，在分子生物学评估研究中具有一定的前景。本研究旨在研究轻中度肝纤维化肝脏ADC值变化与MMP-1 mRNA的表达相关性，为下一步MMP-1基因沉默干扰肝纤维化提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 动物模型建立

实验大鼠来源于海南省实验动物中心，采用随抽样机法分为模型组和对照组。本研究中大鼠模型组总共32只，体质量165～206g，造模采用腹腔注射猪血清（市场购买猪血、离心取血清）法[7]，剂量0.5mL/次，每周2次，食物亦购自海南医学院医学动物实验中心，常规自来水饮用。

1.2 MRI-DWI及后处理计算ADC值

MR检查使用西门子3.0 T磁共振机（德国），专业实验动物线圈，后处理软件[Function Tool（GE AW 4.4）]。技术扫描方案及参数参考战跃福[7]等研究:扫描前6h禁止饮食、饮水，采用戊巴比妥钠（1%）1.0 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉。为防止过度呼吸运动及检查室温度过低采用自制棉带腹部加压固定，体位采用俯卧位，并调整肝脏位于线圈中心。MRI-DWI检查b值=800 s/mm2，SE-EPI序列加脂肪抑制。扫描参数参考战跃福等[7]研究:TR=3000 ms，TE=75.6 ms，层间距=0 mm，层厚=3.0 mm，NEX=8，FOV=100mmX100mm，矩阵=192×192。专配后处理工作站，取肝脏3个感兴趣区取平均值[7]，距离肝包膜应＞1.0cm，尽量避开肝内胆管、肝脏血管等干扰。

1.3 肝脏组织病理学检查（HE、Masson三色染色、网状纤维染色）影像学检查完成后过量麻醉剂处死大鼠，采用

4%多聚甲醛左心灌注固定以排除血液对组织学标本的影响。尽量选择影像肝脏感兴趣区靶标本取材，病理学检查。病理结果判读由病理科两位高年资主治医师以上判读结果。根据中华医学会共识[11]。因为共识[11]中更加注重显著肝纤维化的临床意义（METAVIR≥S2或Ishak≥S3定义为显著纤维化），因此本研究将S1期归为轻度肝纤维化组，S2、S3期归为中度肝纤维化组，

1.4 MMP-1 mRNA检测

根据解剖学定位选取与肝脏DWI成像ROI相同区域肝脏组织进行Real time PCR检测。按总RNA试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）说明书提取肝脏总RNA。MMP-1、G3PDH Real Time-PCR扩增引物（上海生工合成）根据Okamoto[12]、Wasser[13]设计。MMP-1，forward primer:（5’-TCG TGA GAA TGT CTT CCC ATT-3’），reverse primer:（5’-TCTTGGATTG ATTTGAGATAAGTGAAATC-3’）；G3PDH forward primer:5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATGG-3’，reverse primer:5’-CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG-3’。Real-time-PCR根据TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、SYBR Premix Ex Taq II说明书进行检测肝脏组织MMP-1表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件包，数据以表示。统计学方法采用单因素方差分析、SNK法、Pearson相关分析。

2 结果

2.1 大鼠肝纤维化模型的建立及病理组织学检查

模型组大鼠32只中，图像不符合分析要求2只，最终符合轻度肝纤维化组11只，中度肝纤维化组15只。对照组8只大鼠均完成DWI检查。

HE染色:S1期肝纤维化汇管区可见纤维增生（见图3A），到中度肝纤维化则可出现桥接纤维化（见图4A）；Masson三色染色:S1期肝纤维化胶原纤维可见染色（图3B），到中度肝纤维化组蓝染则增多（见图4B）。网状纤维染色:S1期肝纤维化可见黑褐色染色（见图3C），到中度肝纤维化组黑褐色染色明显增厚，并可出现小叶内瘢痕（见图4C）。

2.2 影像学及分子生物学结果（见表1）

表1 三组大鼠肝脏ADC值及MMP-1 mRNA相对表达量

2.3 三组大鼠肝脏ADC值及MMP-1 mRNA表达相关性

对照组、轻-中度肝纤维化组大鼠肝脏ADC值与MMP-1 mRNA表达Pearson相关系数为0.64（P＜0.05），结果提示呈正相关。

3 讨论

3.1 肝纤维化分组及模型的选择及意义

美国肝脏疾病指南上[5]也指出肝纤维化F2期被认为具有重要的临床意义；国外学者Ronot[6]等认为中度肝纤维化是慢性肝病诊断和治疗的重要阶段。因此本研究根据指南及学者的研究[5，6]选择轻-中度肝纤维化组的功能影像及分子生物学研究更具有临床价值。本文采用的是免疫法猪血清腹腔注射造模，其肝纤维化形成过程虽然较长，但确是研究肝纤维化转归较可靠的模型[7，14，15]，为下一步MMP-1基因沉默干扰肝纤维化提供实验基础。

3.2 影像学评估肝纤维化-肝硬化

目前超声弹性成像虽已经写进肝纤维化评估指南中，是目前比较可靠的影像学评估方法，但对操作者仍具有一定的要求，且普及并不是太广，对基层医院推广价值仍有一定限制；CT灌注成像评估参数较多，评估价值也比较显著，临床应用前景也非常广泛，但辐射剂量仍是制约其全面推广的主要原因；磁共振功能成像，如DWI，MRS，PWI，BOLD等多种影像技术方法，其中DWI应用最为广泛且最具有前景。ADC值虽已广泛应用于肝纤维化的研究[7～10]，且b值选取800 s/mm2普遍认为图像质量清晰，评估能力最佳，但对于早中期肝纤维化的诊断价值尚有一定争议。

3.3 MMP-1 mRNA表达在轻中度肝纤维化中的意义及ADC值反映MMP-1表达的能力

本文研究结果轻-中度肝纤维化MMP-1 mRNA表达呈下降趋势，MMP-1广泛存在于肝脏中，被肝细胞、枯否氏细胞等分泌，由轻度肝纤维化进展为中度肝纤维化，肝脏炎性反映加重，MMP-1必然亦随之减少[3，4]，因而MMP-1在肝组织中的表达水平可以真实反映肝纤维化程度。本文研究结果显示轻度肝纤维化进展为中度肝纤维化，大鼠肝脏DWI-ADC值同病理分期表达相一致，且同国内外学者研究一致[7～10，15]，ADC降低有统计学意义，是由于I、III型胶原纤维的增加，导致水分子弥散受限所致。

战跃福[7]研究结果提示ADC值不能区分S1与S2期、S2与S3期，国内范国华[8]研究结果也提示ADC值不能区分S2与S3期；有学者指出原因可能由于存在部分病例病理分期上的重叠；综上所述ADC值在评估肝纤维化精度上确实存在较多的影响因素，仍有待进一步研究。本研究结果显示S1期与S2、S3期间肝脏ADC值及MMP-1 mRNA表达均具有统计学意义，虽然轻-中度组间仍有一部分病理分期存在重叠，但较战跃福[7]、范国华[8]等研究在分组上更具有临床探讨价值。