凝缩蛋白复合物亚基NCAPG增强非小细胞肺癌铂类药物敏感性的机制研究

朱荔丰，丁晓芬，郭玛丽，苏标华，樊燕丹，孙英明，2，李智军

（1.福建医科大学附属三明第一医院肿瘤内科，福建 三明 365001；2.美国俄亥俄州立大学Wenxer医学中心放射医学系；3.内蒙古自治区人民医院放射治疗科）

肺癌是我国乃至全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）约占90%[1]。由于肺癌早期症状不明显，约40%～60%患者就诊时已发生局部或远处转移。尽管随着肺癌的治疗进入靶向时代和免疫时代，但仅仅约20%～40%患者能从中获益，总体而言肺癌预后仍较差，五年生存率只有16.8%[2]。化疗是目前延长晚期肺癌患者生存期及提高生活质量有效的方式，而含铂两药方案是晚期肺癌治疗的基石。顺铂于1978年被美国FDA批准用于恶性肿瘤治疗，目前仍为肺癌化疗的一线用药。其作用机理为铂原子与DNA形成交联反应（crosslink），使其发生DSB导致细胞凋亡。虽然铂类药物给肺癌患者带来了一部分临床获益，但以铂类为基础的肺癌化疗仅仅只有7～9个月的PFS，克服顺铂耐药一直是全世界科研人员追踪的热点[3]。

NCAPG是一种有丝分裂相关的染色体凝缩蛋白，是由1015个氨基酸组成114.5KDa的蛋白。目前研究表明，NCAPG在前列腺、肝癌等肿瘤中异常表达[4，5]。NCAPG参与有丝分裂染色体凝聚，与细胞周期有关，其主要功能使染色体重组为棒状有丝分裂染色体，确保细胞分裂过程中姐妹染色单体的分离。Chengwu Gong等报道，其可以影响肝细胞肝癌增殖、迁移，并促进其凋亡[4～6]。然而，NCAPG在肺癌中功能研究甚少，本研究通过生物信息学结合体外实验，探索NCAPG在非小细胞肺癌中的功能。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料及试剂

NCAPG过表达质粒委托上海吉玛公司合成，NCAPG抗体（Abcam公司Cat No.226805），BCLAF1/BTF抗体（Abcam公司Cat No.ab226830），BCL2抗体（Abcam公司Cat No.ab32124），Cleave-PARP抗体（CST公司Cat No.#9548），γ-H2AX（Ser139）CST公司Cat No.#5438）。主要仪器：ECO2150型二氧化碳细胞培养箱（德国梅德勒公司），FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司），全自动酶标仪ELX800NB（美国BIOTEK公司），PCR仪（美国Bio-Rad公司），激光共聚焦显微镜（日本尼康公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养HT-1975细胞10%胎牛血清、10%青霉素链霉素双抗的PRMI-1640完全培养基培养于37℃、5%CO2、90%湿度的培养箱中，常规换液传代。转染质粒参考lipofectmin3000 protocol。

1.2.2 Western Blot检测蛋白表达60～100mm细胞培养皿培养NCI-H1975细胞，药物处理前PRMI-1640饥饿6h，用PIPA buffer收集细胞，提取总蛋白，样品进7.5%～10%SDS－PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉TBST封闭1h，一抗4℃过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL发光液显影。

1.2.3 免疫荧光 将多聚赖氨酸包被24mm玻片置入6孔板中，5×105接种于6孔板中，药物处理完成后，使用4%多聚甲醛固定20min，曲拉通100通透后，以5%BSA封闭1h，一抗4℃过夜，PBST洗5次，加入不同荧光标记的二抗，室温孵育1 h，Hochest33342染核5min，PBST洗5次后，上机检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0软件进行统计处理，各指标数据采用均数±标准差表示，各组均数比采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组比较采用LSD法，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NCAPG在肺癌组织中高表达、与肺癌分期及分化呈正相关

通过Oncomine数据库来自Hou等提供数据库（见图1A），其中肺癌组织45例，癌旁组织65例（见图1A），其余为Oncomine数据（见表1）。我们发现NCAPG肺癌组织中高表达（见图1B），在TCGA数据库中无论腺癌组织（腺癌483例，癌旁347例）还是鳞癌组织组织（鳞癌486例，癌旁338例）中NCAPG表达均较癌旁组织表达升高（P＜0.05），免疫组化标本中可以明显观察到肿瘤组织NCAPG高表达（见图1C），其表达定位于细胞核中。通过Gepia网站分析，NCAPG表达与肺癌分期及分化呈正相关（见图1D、1E），综上所述，我们可以认为NCAPG作为一个癌基因参与了肺癌发生、发展的过程。

表1 Oncomin数据库中肺癌组织与癌旁组织NCAPG表达情况

2.2 NCAPG高表达与预后呈负相关，与化疗疗效正相关而与放疗疗效无关

我们用TCGA数据库和KM PLOTTER数据库评估了NCAPG与非小细胞肺癌预后的关系，TCGA数据库（见图2A）及KM PLOTTER数据库（见图2B）均提示其表达与患者预后负相关。同时我们在KM PLOTTER数据库分析NCAPG表达与放化疗的关系（见图2C）。患者接受化疗后，NCAPG高表达患者预后明显优于NCAPG低表达患者（P＜0.05）（见图2D、2E）。对于未接受化疗患者，NCAPG高表达预后不佳（P＜0.05）。令人意外的是，即使患者接受放疗，NCAPG表达如何与预后无关（P＞0.05），然而在未接受放疗患者中，NCAPG高表达的患者预后依然较差（P＜0.05）（见图2F）。该结果预示着NCAPG表达与患者化疗敏感性有关，提示NCAPG高表达患者更能从化疗中获益。

2.3 NCAPG通过调节BCLAF1增强肺癌细胞对顺铂敏感性

我们在Oncomine数据库探索NCAPG表达量与顺铂敏感性的关系，发现在顺铂敏感的肺癌患者中，NCAPG表达量升高（见图3A）。进一步分析NCAPG在肺癌不同顺铂敏感性相关基因，我们发现在无论顺铂是否敏感患者中，BCLAF1与NCAPG表达均呈正相关，其表达相关性R=0.779，表明BCLAF1与NCAPG表达高度一致（见图3B）。为了进一步验证上述结果，使用TCGA数据库再一次验证BLCAF1与NCAPG之间相关性，呈明显正相关，R=0.45，P＜0.05（见图3C）。接着我们构建了NCAPG过表达质粒，其随着NCAPG表达升高，BCLAF1也随之升高，并且顺铂能诱导BCLAF1表达，同时抑制了BCL2表达（见图3D）。我们又检测了PARP剪切体，过表达NCAPG对细胞凋亡作用不明显，但是表明NCAPG过表达与顺铂具有协同作用。我们再一次用免疫荧光法验证DNA损伤程度，我们发现过表达NCAPG能略微造成DNA损伤，但与对照组比无明显差别，过表达NCAPG依然能显示出和顺铂的协同作用（见图3E）。

3 讨论

NCAPG编码染色体凝集蛋白复合体的一个亚单位，负责有丝分裂和减数分裂过程中染色体的凝聚和稳定。先前研究表明NCAPG参与包括前列腺癌、儿童胶质瘤、肾癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤等多种肿瘤的发生、发展[7，8]。我们运用利用生物信息学分析，研究发现NCAPG是肺癌发生发展的关键基因。此外，近年来越来越多的证据表明，NCAPG的异常表达与肿瘤发展有关。有学者通过加权基因共表达网络分析，NCAPG是一种肿瘤生物标志物[9]。同时，我们通过分析来自Oncomine数据库的5个微阵列数据，均发现NCAPG在NSCLC中上调。目前国内外对NCAPG对肿瘤增殖、迁移等影响较多，本研究首次发现NCAPG与化疗患者预后相关，从另一个行的角度剖析NCAPG的作用。由于铂类为主的化疗是目前NSCLC治疗的标准方案，我们推测NCAPG表达高患者能从化疗获益可能与其能增加化疗敏感性有关。我们通过数据库分析，得到BCLAF1可能是NCAPG作用的关键因子。

BCLAF1是一个该基因编码一个转录抑制因子，与BCL-2蛋白家族的几个成员相互作用。该蛋白过表达可诱导细胞凋亡，bcl2蛋白共表达可抑制凋亡[10]。该蛋白定位于整个细胞核的点状结构，并在经历凋亡的细胞中重新分布到核膜附近的区域。文献报道BCL-2的抗凋亡作用是顺铂耐药关键基因[11]。

我们的研究表明，过表达NCAPG即使能诱导BCLAF1表达，但是没有明显促进凋亡作用，Cleave PARP并没有明显升高，表明这种促凋亡作用可能被其他抗凋亡蛋白对其有拮抗作用，当用顺铂处理后，这种拮抗作用对抵消，NCAPG过表达很好显示出了与顺铂的协同作用。

我们虽然初步讨论了NCAPG化疗增敏的机制，当也在一定缺陷，未进行BCLAF1的挽救实验，只能间接直接证明NCAPG通过BCLAF1调节非小细胞肺癌化疗敏感性。本研究结果表明，NCAPG高表达患者预示着更容易从化疗中获益，并能逆转其高表达带来的预后不良因素，为个体化治疗提供了理论基础。