选择性COX-2抑制剂联合顺铂对肺癌新生血管的影响

魏 慧，张 卿

（1.内蒙古自治区人民医院呼吸与危重症医学科，内蒙古 呼和浩特 010017；2.内蒙古医科大学附属医院呼吸内科）

任何肿瘤的生长和转移都依赖于血液供应[1]，肿瘤血供丰富，营养充分，导致肿瘤快速生长、恶化、转移。血管新生依赖于促血管生长因子，目前促进血管新生的生长因子主要有bFGF、COX-2、TGF-β1等，它们能促进血管内皮细胞分裂增殖[2]，诱导肿瘤血管生成。肺癌是我国患病率最高的恶性肿瘤[3]，其中非小细胞肺癌最多见[4]，约75%～80%。

本研究前期实验表明:COX-2在肺腺癌中高表达，并可促进肺癌细胞生长与增殖[5]。目前，国内外研究表明[6，7]，非甾体抗炎药（NSAID）有抗肿瘤的作用，而且有协同传统化疗药物发挥抗肿瘤作用。尤其选择性COX-2抑制剂因其副作用小，已被应用于结肠癌、直肠腺癌的临床实验中[8]。

本研究旨在探讨选择性COX-2抑制剂联合顺铂的抗肿瘤作用，为肺癌提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肺癌细胞株A549，购买于中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所。试验动物:4周龄雌性BALB/C裸鼠32只，体重16～18g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司【试验裸鼠许可证号SCXK（京2012-0001）】。

1.2 测量瘤重、对肺癌A549裸鼠移植瘤组织内血管生长因子测定

瘤重抑制率=（对照组移植瘤重-用药组瘤重）/对照组瘤重×100%；免疫组化检测肿瘤组织内bFGF、COX-2、TGF-β1血管生长因子。

1.3 结果判定

应用免疫组织化学和形态计量方法，用CD31标记微血管，置于显微镜下，计数采用微血管金标准法，COX-2阳性染色定位于胞质和胞膜染色，呈棕黄色着色，b-FGF、TGF-β阳性染色定位于胞浆/胞质染色，呈棕黄色弥漫着色。每个标本切4张片子进行染色，利用阳性细胞数评定。阳性细胞数评定法[9]:采用9分评分制，按照阳性细胞率和染色强度分别计分。

1.4 统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态性检验采用单样本K-S拟合优度法。计量资料以表示，两样本间比较采用t检验。多个样本间不同时间点的数据比较采用重复测量资料的方差分析，计数资料以（n，%）表示，数据间比较采用χ2检验。P＜0 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建肺癌A549裸鼠移植瘤模型

裸鼠荷瘤过程顺利，生长状态较好。移植瘤生长过程中，开始裸鼠背部皮下形成圆形、椭圆形、不规则形结节，触摸偏硬，早期肿瘤呈灰白色，表面光滑，之后肿瘤逐渐增大。荷瘤后第8天开始用药，裸鼠生长状态良好。

2.2 NIM单独以及联合DDP对肺癌A549裸鼠移植瘤生长的影响

用药治疗后测量肺癌A549裸鼠移植瘤的瘤重变化，第22天处死裸鼠剥离移植瘤，计算肿瘤瘤重抑制率。NIM+DDP组分别与NIM组、DDP组比较，NIM+DDP组瘤重抑瘤率最强（P＜0.001），总体之间比较F值32.264（见表1）。

表1 用药结束后各组裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

表1 用药结束后各组裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

注：NIM组与DDP组比较，P＜0.001；NIM组与NIM+DDP组比较，P＜0.001；DDP组与NIM+DDP组比较，P＜0.001。

Group Normal control NIM DDP NIM+DDP Tumor weight（g）1.11±0.18 1.01±0.12 0.73±0.07 0.58±0.06 32.264＜0.001 inhibit rate of tumor weigh（%）9.91 34.23 47.75 F P

2.3 NIM单独以及联合DDP对肺癌A549裸鼠移植瘤细胞COX-2、bFGF、TGF-β1蛋白表达的影响

2.3.1 免疫组化测定COX-2在各组肺癌A549移植瘤中的表达COX-2阳性染色定位于胞质和胞膜染色，呈棕黄色着色，每个标本切4张片子进行染色，利用阳性细胞数评定。NIM+DDP组分别与对照组、NIM组、DDP组比较（P＜0.001），COX-2阳性表达呈对照组＞NIM组＞DDP组＞NIM+DDP组。总体之间比较χ2值为45.486（见表2，图1）。

表2 COX-2在各组肺癌A549移植瘤中的表达Tab.2 Expression of COX-2 in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.2 免疫组化测定b-FGF在各组肺癌移植瘤中的表达每个标本切4张片子进行染色，利用阳性细胞数评定。b-FGF在各组肺癌A549移植瘤中的阳性表达呈对照组＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而对照组与NIM组的阳性表达，（P＞0.05），无统计学意义。NIM+DDP与DDP组、对照组、NIM组的阳性表达（P＜0.001）。四组之间总体比较χ2值为44.238（见表3、图2）。b-FGF阳性染色定位于胞浆/胞质染色，呈棕黄色弥漫着色。NIM+DDP组的阳性表达最弱（见图2）。

表3 b-FGF在各组肺癌A549移植瘤中的表达Tab.3 Expression of b-FGF in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.3 TGF-β免疫组化测定在各组肺癌移植瘤中的表达每个标本切4张片子进行染色，利用阳性细胞数评定。TGF-β在各组肺癌A549移植瘤中的阳性表达呈对照组＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而对照组与NIM组的阳性表达，（P＞0.05），无统计学意义。NIM+DDP与DDP组、对照组、NIM组的阳性表达（P＜0.001）。四组之间总体比较χ2值为42.715（见表4，图3）。TGF-β阳性染色定位于胞浆/胞质染色，呈棕黄色弥漫着色。NIM+DDP组的阳性表达最弱（见图3）。

表4 TGF-β在各组肺癌A549移植瘤中的表达Tab.4 TGF-expression in lung cancer A549 xenografts in each group

3 讨论

肿瘤新生血管形成的一系列过程是在新生血管调节因子的严密调控下，使得肿瘤细胞自体分泌的生长因子然后作用于它自身的生长受体，从而形成自分泌循环，刺激新生血管的不断增殖，促使肿瘤细胞无休止的生长与浸润[10]。

本研究前期实验表明:COX-2在肺腺癌中高表达，并可促进肺癌细胞生长与增殖[11]。另有研究表明，bFGF[12]，能直接诱导血管生成，肿瘤细胞产生的bFGF还可以引起TGF-β1表达上调，导致缺氧诱导因子减弱，且三者表达时微血管密度（microvessel density，MVD）显著增加。COX-2是前列腺素合成过程中的限速酶[13]，正常生理状态未见其表达，在血管生长因子分泌过多、癌基因刺激下，机体COX-2表达增强，并通过前列腺素、血栓素途径，刺激血管生成增强，抑制内皮细胞凋亡。本实验结果表明:尼美舒利对肺癌A549裸鼠移植瘤有抑制作用，尼美舒利与顺铂联合对肿瘤生长的抑制作用更强，推测，尼美舒利有协同顺铂起到抑制肺肿瘤的生长的作用。

本实验免疫组化结果显示，COX-2在尼美舒利组与对照组的阳性表达有明显差异（P＜0.05），肺癌中COX-2的表达可被选择性COX-2抑制剂尼美舒利所抑制。我们免疫组化结果还表明，尼美舒利顺铂联合组COX-2的表达分别与尼美舒利组、顺铂组、对照组比较，有显著差异（P＜0.05），有统计学意义。我们前期体外实验研究也得出相同的结果。国外研究表明:在卵巢癌研究中[14]，发现选择性COX-2抑制剂可显著增强肿瘤细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性，二者联合时明显降低卵巢癌细胞株的增殖，降低顺铂的用量。

bFGF[15]能直接诱导血管生成。TGF家族是一类结构、功能相关的多肽生长因子，TGF-β1是其家族成员之一，它的作用是促进VEGF以及bFGF的形成，从而影响肿瘤细胞的增殖、分化[16]。

本研究免疫组化结果显示:肺癌A549裸鼠移植瘤细胞均有b-FGF、TGF-β1阳性表达，两个因子阳性染色均位于胞浆，呈棕黄色弥漫着色，表明尼美舒利单独使用对b-FGF、TGF-β1的下调作用不明显，当与顺铂联合作用于肺癌A549裸鼠移植瘤时，明显抑制b-FGF、TGF-β1的表达，且抑制效果好于尼美舒利组以及顺铂单药组。有研究表明[17]:选择性COX-2抑制剂通过下调胆道肿瘤细胞VEGF、b-FGF的蛋白表达起到抑制胆道肿瘤生长的作用。在非小细胞肺癌及其周围基质细胞中，COX-2、TGF-β1蛋白表达均增加，且瘤内微血管密度增加，选择性COX-2抑制剂通过抑制COX-2的表达下调TGF-β1的蛋白表达，减少微血管的产生，进而抑制肺癌细胞的增殖与生长[18]。

综上所述，选择性COX-2抑制剂有抑制肿瘤生长作用，联合化疗药物可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，即增强顺铂对肺癌的细胞毒作用，从而更好地发挥抗肿瘤效应，在肺癌的治疗中有重要意义，为肺癌的综合治疗提供了新的方案。

4 结论

选择性COX-2抑制剂联合顺铂对肺癌的生长有抑制作用，抑瘤率明显高于顺铂单药组;选择性COX-2抑制剂增强顺铂对肺癌的抑瘤作用，可能通过下调肺癌新生血管因子COX-2、bFGF、TGF-β1的蛋白表达，进而抑制肺癌血管新生，达到协同抗肿瘤的作用。选择性COX-2抑制剂联合顺铂将有可能为肺癌综合治疗提供新思路。