骨骼肌卫星细胞及RNAi对肉品质影响的研究进展

于 红 邢 军 张 瑞*

1.新疆师范大学生命科学学院 新疆乌鲁木齐 8300542.新疆大学生命科学与技术学院 新疆乌鲁木齐 830046

骨骼肌是脊椎动物中一种复杂的动态组织，主要分布在脊椎动物的背部、腹部以及四肢等部位。其中骨骼肌的主体部分主要分布在肌腹部位，色泽红艳且具有收缩能力，存在较高的可塑性。揭示骨骼肌肌肉生长发育机制,并建立体外培养模型,是研究如何提高该肉畜的产肉性能与肉质重中之重。虽然骨骼肌主要由具有核分裂后核的多核纤维组成，但它在受到损伤事件的反应中，具有显著的再生能力。骨骼肌的再生潜力依赖于卫星细胞的活动，即与肌纤维密切相关的肌内单核细胞。Teng[1](2015)等研究发现肌卫星细胞的分化和融合是一个协调的多步骤过程，对骨骼肌的发展和再生及损伤修复都至关重要。Forcina[2](2018)等研究发现卫星细胞通常处于静止状态，激活后会进入细胞周期，与已存在的肌纤维相互融合维持干细胞池，以保证一个有效的细胞转换；然而，当肌肉受到损伤时，卫星细胞的活动能力会受到环境的刺激而增加，开始大量分裂、增殖并相互融合形成肌管，进而形成新的肌纤维，参与肌肉组织的再生；从而改善相关畜禽的肉制品嫩度及口感，影响肉品质的食品安全。

1 骨骼肌卫星细胞与肉品质的关系

骨骼肌卫星细胞能通过细胞被激活，增殖分化为成熟肌细胞，然后融合已存在的肌纤维，保证一个有效的细胞转换，进而影响肌纤维增值分化的整个过程。骨骼肌细胞增殖分化形成的肌纤维组织结构和数量大小，同样也是决定肉用动物肉质好坏的重要因素。由此可知，骨骼肌卫星细胞的生长发育情况与肉品质也同样存在密切的相关性，通过研究骨骼肌卫星细胞的发育改善肉品质，已成为了肉品质研究的新方向。Davis[3](2020)等研究发现卫星细胞是最佳肌肉生长所必需的，并且可能在协调有效的转录反应以适应运动中发挥作用。

1.1 骨骼肌细胞的生长与发育

脊椎动物骨骼肌(skeletal muscle)生长和发育的调控过程都非常的精密。骨骼肌在神经管两侧的近轴中胚层区聚集成肌节，而生成骨骼肌的肌节质细胞是单核细胞，通常呈纺锤形或者双极形，还有一些形状上如成纤维的细胞，也会分化为成肌细胞(myoblast)[4]。成肌细胞通过细胞间的融合作用，产生使肌肉并最终相互融合形成肌管(myotube)，随后单个细胞核附着在肌管的表面，并分化形状多为扁平梭型，且细胞体积较小的骨骼肌的肌卫星细胞(muscle satellite cell)。

最近Yimi[5](2020)研究确认，动物骨骼肌细胞的主要来源是肌卫星细胞。肌卫星细胞作为一种肌源性干细胞存在成年骨骼肌内，随后经过一系列的增殖和终末分化过程，形成成肌细胞，最后成肌细胞可以转变为不同种类的快慢肌纤维[6]。一般来说，大多数肉用动物的肌肉中都会有4种不同的肌纤维类型，即缓慢氧化型(I型)、快速氧化糖酵解型(IIA型)和快速糖酵解型(IIX型)和IIB型[7]，它们在不同肌肉中的相对组成可以决定肌肉代谢特性的优势[8]。在骨骼肌转化过程中的存在很多起到重要调控作用的基因，分别在不同发育阶段，对复杂多变的方式进行相应的组合，最终形成一系列信号通路系统。目前，科学家们已经鉴定出了多种与肌肉发育相关的转录调控基因。不同的肌肉有其独特的内在肌肉纤维类型和分布，这导致不同的代谢模式、生理过程和肉质属性，进而决定肉品质的好坏。

1.2 肌纤维与肉品质的关系

许多研究报道了肉品质特性和纤维结构类型之间的关系，表明肌肉纤维特性很大程度上决定了肉的品质，因此近几年研究者欲通过操纵肌肉纤维特性来改善肉的品质。评定肉品质的指标主要包括肉色评分、持水性、硬度、弹性、蛋白质含量、咀嚼性等[9]。在肌纤维发育过程中，肉品质特性随着肌纤维特性变化也在发生着变化。乌日罕[10](2018)相关研究表明，通过改变肌纤维特性影响肌肉的嫩度主要表现在两个方面：一方面是改变肌纤维直径大小，另一方面是改变肌内脂肪含量。肌纤维直径包括Ⅰ型和Ⅱb型两种类型，Ⅰ型肌纤维直径小较细，会降低肌肉的剪切力，有助于提高肉品的嫩度；Ⅱb型的肌纤维横截面积较大，会降低肉质的嫩度。

与此同时，肌纤维的组成与分布情况也同样是影响肉质好坏的关键因素。酵解型肌纤维的高含量会降低肌肉的持水性能力[11]，肌肉氧化能力同样是一种重要的内在肌肉因素，可以控制肉的颜色，源自于肉表面的肌红蛋白色素与氧气接触，脱氧肌红蛋白从紫色到红色，最后到棕色的肌红蛋白。在肌肉中含有较高MyHCⅠ型、MyHCⅡa型时，肉色呈红色，在肌肉中MyHCⅡb型占比例较多时，则外观苍白。对于刚出生的动物，红白肌纤维的组成区别不大，但是随着动物年龄的生长，红肌纤维含量也随之增加肉质较好。

综上所述，影响动物肌肉的生长及肉品质因素，从根本上取决于肌纤维类型与组成。也有相关研究表明，增加猪长臀肌中快速收缩糖酵解纤维的比例，可以提高肉质中pH值下降的速度和程度。因此，Ⅱb型肌纤维比例的增加必然导致肌肉的增长。就肉质而言，了解肌肉纤维特性与肉质特性之间的关系，将有助于提高肉质的产量。

1.3 骨骼肌卫星细胞与肌纤维的关系

肌纤维的类型、组成成分、数量大小直接调控着哺乳动物的肉品质，而肌纤维的生长情况直接取决于骨骼肌卫星细胞的增殖分化能力。研究中经常通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,此后细胞延展并开始快速增殖。通过增殖、迁徙肌卫星细胞融合进已存在的肌纤维中，来诱导肌纤维的肥大，从而促进肌肉生长。与此同时，秦本源[12](2020)研究表明，由于骨骼肌驻留干细胞肌肉卫星细胞(MuSCs)的活性，肌肉卫星细胞具有优异的再生能力。Fukada[13](2020)研究表明，肌纤维大小对外界刺激、内在因素或身体活动的适应，这被称为可塑性。低体力活动和一些疾病会导致肌纤维尺寸减小，称为萎缩，而肥大指的是高体力活动或合成代谢激素/药物引起的肌纤维尺寸增加。

骨骼肌的再生潜能依赖于卫星细胞的活动。通常情况下，卫星细胞在它们的层下位置保持静止状态，偶尔进入细胞周期，通过融合已存在的肌纤维，以保证细胞间的有效转化。然而，在肌肉损伤后，随着环境刺激的增加，卫星细胞的活动大大增加，从而参与了功能性肌肉组织的再生[14]。脊椎动物中成肌细胞融合一般包含两个阶段。第一阶段，新生肌管的形成取决于单核成肌细胞相互融合；第二阶段，是新生肌管互相融合或新生肌管与单核成肌细胞融合产生成熟肌管，最终发育形成成熟的肌纤维。按照肌纤维的氧化、收缩、代谢及MyHC(Myosinheavychains)异构体表达等特性，肌纤维可分为慢速氧化型肌纤维(I型)、快速氧化型(Ⅱa型)、快速酵解型(Ⅱb型)、中间型(Ⅱx型)4种类型。其中I型纤维的线粒体数目较多但糖原较少，因此具有较高的氧化能力和ATP消耗速率导致I型纤维具有较低的糖酵解潜力，有相关研究建立快慢速性肌肉成肌细胞培养模型，用于研究肌肉生长发育[15]。此外，I型肌纤维的脂质含量较高、纤维直径较大，因此该型肌纤维的肌内脂肪含量和剪切力较高。由于骨骼肌主要由肌纤维组成，鲜肉的品质与肌纤维特性直接相关，通过提高I型肌纤维在肌肉中的比例将可能有效地改善畜禽的肉品质。

研究发现，在骨骼肌分化过程中，融入肌纤维形成了新的肌核，所以卫星细胞随着肌纤维生长发育而逐渐减少。肌纤维组织学特征可以保持相对恒定的原因是由于在肌纤维达到成熟期时，卫星细胞将处于相对静止状态。苏琳[16](2014)等对苏尼特羊股二头肌的肌纤维特性与肉品质相关性的研究发现，苏尼特羊随着肌纤维密度的增加，粗脂肪随之增加而剪切力随之减小，且也发现其中ⅡB型肌纤维比例最高。肌卫星细胞的含量和异质性是调控品种间和组织间肌纤维构成不同的关键因素[17]。因此可得出结论，肌纤维的发育与骨骼肌卫星细胞的数量、增殖和分化能力在哺乳动物的整个生命周期中起着重要作用。

2 影响SMSCs增殖分化的因子PHam

在骨骼肌卫星细胞的生成发育过程中，经过一系列形态、细胞和分子生物学方面的变化，最后通过终端分化形成了多样性的成肌细胞，最终分化为多种类型的快、慢肌纤维。这些变化的基本前提是一系列基因在转录水平上精确表达调控，而这些调控在某一时期以及某一特定的发育阶段，各种转录因子以多种多样的方式进行特定的组合，形成了多种形式信息组成的复杂的信号通道系统而进行精确的调控。参与调控这一过程的因子主要包括Id(DNA结合抑制子)、Pax-3蛋白、肌肉调节因子MRFs(MyoD、Myf5、Myogenin及MRF4)、MEF2(肌细胞增强因子)等。

2.1 Pax因子

目前研究表明，PAX基因家族在进化上高度保守，人和小鼠的PAX基因有9种(PAX1-PAX90)，每个都有自己的生物学功能。实验证明，出生后骨骼肌细胞的增殖和再生，主要依赖于成体干细胞——卫星细胞。卫星细胞的特点是配对盒转录因子PAX7的表达。有报道显示在C57/BL6小鼠中，用萝卜硫素(SF)处理卫星细胞样(C2C12细胞)，在增殖和分化(即肌管/肌纤维的形成)过程中激活Nrf2/抗氧化信号，可导致了MyoD，PAX7，MyH2的表达减少，进而影响肌卫星细胞的分化[18]。在卫星细胞的存活、增殖等过程中，PAX7因子充当着不可或缺的作用，且在卫星细胞中的持续表达中可推迟肌肉发育的生成。相关研究表明，敲除PAX7和其同源物PAX3的基因，会造成肌卫星细胞分化为软骨或其它类型的细胞甚至死亡。两者都能够激活骨骼肌转录因子上游MyoD基因的表达启动肌肉生成。PAX7在卫星细胞从增殖到分化的过渡阶段，通过控制MyoD基因的表达，防止肌细胞生成素基因的诱导和肌肉的过早分化。虽然PAX3与PAX7的有些功能在骨骼肌发育过程中相似，但是由卫星细胞介导的骨骼肌再生的过程中，PAX3却不能替代PAX7。在卫星细胞被激活后，PAX3也不能代替PAX7的抗凋亡作用。

2.2 生肌调节因子家族(Myogenicregulatoryfactors,MRFs)PH

肌肉调节因子家族(muscleregulatoryfactors，MRFs)又称为生肌决定因子(MyoD)基因家族，在骨骼肌生长发育的过程中，起着激活与调控肌细胞的增殖和分化的作用。生肌调节因子(MRFs)家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6这4种肌肉特异性转录因子，肌细胞的增殖和分化由肌肉调节因子控制着，这些调控因子与肌纤维的数量和大小也有密切关系，进而对肉质和风味也起着非常重要的作用[19]。这些调节因子可以激活肌肉特异性的转录，是骨骼肌细胞分化成熟的关键机制。高玲[20](2015)等研究表明，Myf5和Myf6两种突变类型与肌内脂肪含量，大理石花纹，系水力和嫩度有较大相关性。此外，Myf4基因的突变与肉的嫩度和系水力有较大相关性[21]。

在肌细胞生长发育过程中，MyoD基因既能够把处于静止期的不同类型细胞转变为成肌细胞，又能加强成肌细胞融合并分化为成熟的肌纤维的能力。任霆[22](2014)，Bongiorni[23](2014)等研究表明，MRFs家族成员表达顺序首先是Myf5，其次几乎同时表达MyoD和MyoG，最后当肌管成熟时表达Myf6。MRFs基因家族作为调节骨骼肌的关键基因，与肌纤维的类型、组称、含量以及家畜的产肉能力、肉品质及风味都有着相关性，被公认为影响肉质性状的重要候选基因。

2.3 成肌增强因子(Myoccytespecific-enhancerfactor2,MEF2)

肌细胞增强因子又称成肌增强因子，属于MADS超家族(Myocytespecifific-enhancerfactor2，MEF2)，广泛存在于多种生物中。在哺乳动物体内，MEF2基因家族有4个成员：MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D下，而在肌肉发育过程中起到重要作用的是MEF2A。此外，也有相关研究鉴定出，两个关键基因肌钙蛋白T1(TNNT1)和肌球蛋白调节轻链9(MYL9)在骨骼肌的生长发育中发挥重要作用[24]。

2.4 负调控因子(Myostatain,MSTN)

肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)，又称为生长分化因子8(GDF-8)，是转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族的成员之一，是骨骼肌生长和发育的负调控因子，主要抑制成肌细胞的增殖。相关研究表明，突变小鼠骨骼肌肥大是因为肌细胞数量的增生和肌纤维的肥大，从而得知MSTN对于骨骼肌生长发育而言是一种具有负调控功能的基因。后来学者将该基因命名为肌肉生长抑制素(Myostatin)即MSTN基因，MSTN基因突变而导致的一种双肌现象。双肌性状是因为MSTN基因发生了两处突变：第一处是发生在外显子1中的碱基C替换为A，导致苯丙氨酸被亮氨酸代替；第二处发生在外显子3中，碱基G替换成A，导致色氨酸替代半胱氨酸，导致MSTN的功能受到了抑制。高丽[25](2016)等对非双肌牛MSTN基因的分析表明，该基因的突变是造成双肌现象的重要原因之一，基因突变的牛会出现双肌症状，肌纤维肥大，肌肉量显著增加，皮下脂肪减少，肌间脂肪增多，肉质香嫩。

Ohtsubo[26](2017)等研究发现APOBEC2也是肌肉再生中成肌细胞分化的关键负调控因子。相关研究证实，apoB mRNA编辑酶能够催化多肽家族成员APOBEC2的缺失，最终导致肌肉质量减少，肌纤维增加，核位于中心，造成肉用动物的营养不良。而且APOBEC2在骨骼肌和心肌中作为主要表达，仅仅在野生型成肌细胞培养的早期分化阶段表达升高。对小鼠中的APOBEC2基因进行敲除，结果显示，成肌细胞培养的原代肌管形态正常，融合指数在成肌细胞早期升高，与此同时，肌球蛋白重链(MyHC)、肌原蛋白及其协同因子MEF2C表达水平也随之升高。

2.5 其他影响因子

Horibata[27](2020)等利用小鼠成肌细胞C2C12细胞和人类原代成肌细胞研究了磷脂酰胆碱转移蛋白(StarD7)在骨骼成肌细胞分化中的作用。将蛋白重新导入StarD7敲除C2C12细胞后，线粒体PC水平和耗氧率的降低、myomaker、myomerger和PGC-1的低表达以及肌原性分化受损均得到完全恢复，结果表明StarD7在哺乳动物骨骼肌生成中起重要作用。Zhang Ruimen[28](2020)等将角鲨烯环氧苷酶(Squalene epoxidase,SQLE)过表达载体转染牛骨骼肌源性间充质干细胞、基质细胞(MSCs)，研究SQLE通过肌发生调节肉质的分子机制。分析了SQLE在牛胚胎和成年、4个不同牛品种的肌肉组织和广西牛品种的11个不同组织、器官中的表达。结果表明，牛SQLE基因在脑组织中的相对表达量最高，在成年肌肉组织中的相对表达量明显高于胚胎期。尤其在细胞分化阶段，SQLE表达明显上调。此外，增殖、细胞周期、凋亡和成肌细胞分化实验表明，SQLE显著促进牛骨骼肌源性间充质干细胞的分化和凋亡，但抑制其增殖。研究揭示了SQLE在成肌细胞分化中的作用。此外，有研究围绕Lnc247对骨骼肌再生过程中重要的转录调控因子Foxk1的作用及对骨骼肌损伤修复的影响进行了研究。沈浩[29](2019)研究结果显示过表达Lnc247对Foxk1基因的表达具有负调控作用，即Lnc247的表达能够促进受损肌纤维的肌源性分化，加快骨骼肌损伤修复的过程。说明骨骼肌在损伤后需要更多的能量和物质的合成来修复受损的肌纤维。

3 RNAi与骨骼肌细胞

3.1 RNAi的介绍

RNA干扰(RNAinterference)是双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象。该作用是通过靶向降解mRNA或阻止mRNA翻译为蛋白质来实现基因沉默，在食品安全评价方面起着重要作用[30]。随着人们对基因生物学功能研究的深入，RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用，也已延伸到功能基因组和人类疾病基因治疗的相关研究中。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术将为基因组等方面的研究提供一条新的途径[31]。

3.2 在哺乳动物中应用RNAi技术的主要策略

大量研究证实，利用基因沉默的酶学机制——RNAi机制，在哺乳动物中进行稳定性基因沉默是可行的。常规的基因敲除方法完全破坏基因的功能，只能得到该基因在最重要的生物学事件所起的作用。而RNAi则不能完全抑制基因功能，因为它可以获得阀值效应信息，根据RNAi作用的强弱会表现出一定表型。通过构建相对简易性和稳定性的RNAi载体，使RNAi有希望成为功能基因组研究的重要手段。

RNAi技术在哺乳动物细胞中的运用一般依赖于3种小RNA类型。第一种是长dsRNA分子，是由体外转录的正义和反义链退火或转录成一条具有反向重复序列的单链，进而形成具有发夹样结构的dsRNA，只有少数细胞系在转染长dsRNA后能引发特异性反应，对胚胎细胞的研究有很大的帮助[32]；第二种是小干涉RNA(siRNA)，小干扰RNA是一种碱基长度为21～24bp,由长ds RNA被类核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)的Dicer加工而成的双链RNA，其主要生物学功能是参与RNA干扰(RNA interference，RNAi)，由于小于30个核苷酸的ds RNA不会引发非特异的副反应，因此si RNA可作为介导RNAi效应的有效载体运用于哺乳动物相关基因功能研究中[33]；第三种是体内表达RNA，这种方法是利用传染或者感染的方式将表达RNAi作用的DNA载体导入哺乳动物细胞中，在细胞中以游离或细胞基因整合的形式存在，随后被RNA聚合酶III起始和终止RNA分子的转录，可作为哺乳动物细胞中获得稳定RNA干扰的有效方法[34]。

以下几种方式可防止在哺乳动物细胞中进行RNAi时发生非序列特异性反应。

(1)明确是未分化的具有早期胚胎发育阶段特性的细胞，如卵母细胞，未分化的ES细胞，胚胎瘤细胞等；

(2)使用的监视系统，要具有能够躲避干扰素、足够短、不会激活PKR的能力；

(3)使用能被Dicer酶加工成siRNA的类miRNA茎环结构。RNAi在细胞质中也发挥着许多功能作用，因此，目标mRNA的细胞定位可能影响观察到的效力。

3.3 RNAi的相关功能及其在肉品质中的应用

随着对肌肉生长抑制素的作用机理、调控机制的深入研究，RNAi的应用前景广泛，碱基突变的双肌牛比其他品种牛具有更高的瘦肉率和优质肉块百分率，显示了基因在动物生产上存在巨大的商业价值。研究者分别将基因干扰、基因敲除、转基因等技术应用到畜牧生产上，为提高肉品质工作开辟了新的途径。

以通过RNAi手段使功能未知的结构基因沉默，进而对该结构基因进行功能研究。目前，人们从哺乳动物基因的功能研究中发现，利用RNAi技术得到的基因功能表现结果与基因敲除得到的结果一致，说明RNAi技术完全可以运用到改善基因功能等方面的研究上。研究者对畜禽肉用性状的研究，主要集中在瘦肉量和肉质上。MSTN是在家畜、家禽等经济动物中普遍存在的特异性抑制肌肉加倍表型的基因，通过敲除MSTN基因或使该基因发生突变，就能引起动物双肌现象提高肉品质，因而MSTN是提高肉用动物肌肉产量的理想靶基因。研究MSTN的结构和功能对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有重要的理论意义，同时将为畜牧业肉用类动物育种开辟一条新的途径。

通过分子生物学手段利用RNAi技术控制肌肉抑制素基因或其他相关基因，可以提高畜禽的肉产量，从而获得重大经济效益。与此同时，利用RNAi对肌肉抑制素基因功能的定向靶位缺失，能够在不影响动物繁殖能力和健康状况的前提下，提高畜禽产肉性能，为动物育种和动物基因工程等方面提供全新的研究方向。目前，RNAi在遗传育种以及食品安全方面上的应用尚处于初级阶段，在未来相关学术研究中将发挥巨大的作用。

4 小结

随着当今社会经济的快速发展，人们对衣食住行等方面的需求也在日益提高。作为高蛋白、营养层度相对丰富的肉类食品，亦成为人们日常生活中不可或缺的一部分，其食品安全与肉质口感也越来越受大家的重视。影响肉品质的因素多种多样，包括年龄、饲养方式、品种等。其中羊肉中纤维含量则直接影响肉制品的嫩度与口感，而影响肌肉纤维含量的直接原因是骨骼肌细胞的增值分化，对骨骼肌细胞的相关研究已成为近年来比较热门的话题。许多研究集中在品质特性和纤维特性之间的关系。在改善肉品质方面，肌纤维的组织学特性是畜禽肉品质的重要因素，而骨骼肌卫星细胞可以改变肌纤维类型，因此通过调控肌卫星细胞的增殖分化达到其目的。

本文综述了骨骼肌细胞与肉品质之间相关性、相关因子在肌卫星细胞增殖分化中的作用机制和RNA干扰在哺乳动物研究中的运用。目前，通过调控骨骼肌卫星细胞的增殖发育改变肌纤维特性，进而影响畜禽肉品质的研究才刚刚起步，但它有望成为将来提高肉品质的重要手段。