乳腺癌肿瘤微环境中间质细胞介导的化疗耐药性研究进展

陈 都 钱 诚

乳腺癌是一种异质性疾病，根据其肿瘤相关标记物表达情况可分为Luminal A、Luminal B、HER-2阳性及Basal-like型乳腺癌，不同的分子亚型其预后差异很大。随着我们对乳腺癌的早期诊断及其生物学行为的认识不断提升，生存率也得到了显著改善，但仍有约30%的患者会因耐药而出现复发[1]。虽然人们曾认为这与肿瘤细胞的遗传改变有关，但现在已经认识到肿瘤细胞周围邻近组织在肿瘤的发展和耐药中发挥着重要的作用。很明显，许多"正常"细胞通过改变微环境成分、间质细胞比例和/或激活状态来实现肿瘤的多样性。

肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)是由癌细胞与肿瘤间质细胞、周围上皮细胞、细胞外基质、周围血管组织及信号分子相互作用形成的动态系统[2-3]。肿瘤间质成分主要包括间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)、肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAFs)、肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)、血管内皮细胞。在TME中肿瘤间质细胞与细胞外基质及细胞因子可通过相互作用，影响乳腺癌的生物学行为[3]。乳腺癌TME存在明显的异质性，其异质性取决于微环境中不同组分在肿瘤内的位置，位于肿瘤边缘的细胞类型与位于肿瘤核心的细胞存在显著差异[4]。这种差异主要由肿瘤细胞突变、坏死、免疫浸润和间质压力改变所引起[5]。虽然每一类恶性肿瘤都具有其独特的生物学行为，但在不同类型的肿瘤中，TME的主要组分及其在肿瘤发生发展中的作用却十分相似[3]。细胞与微环境之间的双向信息传递是正常组织维持稳态所必需的。然而，它也是肿瘤生长所必需的。另外，肿瘤细胞与其周围间质的相互作用也是产生化疗耐药的重要原因[6]。肿瘤间质细胞与肿瘤的耐药性存在密切联系，其中肿瘤间质的基因差异性表达与乳腺癌患者的预后相关，而与乳腺癌亚型无关[7]。在乳腺癌的抗肿瘤治疗过程中，肿瘤的药物反应并不完全取决于癌细胞的内在特性。其中，MSCs、CAFs与CSCs之间的相互作用可介导乳腺癌细胞产生耐药，并影响其增殖、侵袭和转移。TME中的MSCs可分化为CAFs[8]，而周围脂肪组织也为其TME的间质成分提供了丰富的MSCs和CAFs来源[9]。然而，MSCs和CAFs之间的联系至今仍尚未完全明确。最近有研究表明，二者在促进肿瘤激活方面具有相似的特性。相反，相关研究却认为二者之间的作用并不相同[10-11]。综上所述，明确乳腺癌TME中肿瘤间质细胞介导的乳腺癌化疗耐药的分子生物学机制，有望为开发新药提供指导，为乳腺癌治疗提供新思路。

1 乳腺癌微环境中几种重要的间质细胞

1.1 MSCs

MSCs是一种多能梭形细胞，广泛存在于人体组织中，可分化为骨、骨髓基质等多种组织。MSCs还可分化为多种间质细胞系，对恶性肿瘤的生物学行为产生影响。在乳腺癌中MSCs可直接通过缝隙连接、膜受体、微管或间接通过可溶性分子向癌组织迁移。在移入肿瘤组织后，整合到肿瘤间质中并与其微环境中各组分相互作用获得不同的特性[12]。然而，截止目前MSCs在乳腺癌TME中的作用仍尚未完全弄清楚。大量的研究表明，MSCs在乳腺癌的整个肿瘤生物学行为中发挥了重要作用。例如，MSCs可通过分泌转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)促进肿瘤上皮间质转化、释放血管内皮生长因子促进肿瘤血管生成、产生C-X-C基序趋化因子配体-12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL-12)促进肿瘤细胞增殖和存活。此外，MSCs也可通过旁分泌或内分泌等细胞内通讯方式与乳腺癌细胞相互作用。例如，MSCs可分泌囊泡激活胞外信号来调节激酶通路，增强乳腺癌细胞的耐药[13]。与此同时，Kucerova等[14]还证实MSCs具有促进肿瘤转移的能力。

与上述作用相反的是，MSCs还具有抑制肿瘤细胞生长的特性。MSCs可通过抑制细胞增殖相关信号通路(如磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶PI3K/Akt、Wnt/β-catenin)、抑制细胞周期进程和抑制血管生成等多种途径抑制肿瘤生长[15-17]。最近有研究发现，在细胞毒性药物的作用下，MSCs可通过P2X信号通路介导乳腺癌细胞产生耐药并增殖，而β干扰素(Interferon-β，IFN-β)的表达可抑制乳腺癌细胞生长[18]。此外，MSCs亦可通过分泌TGF-β对肿瘤产生免疫抑制作用。例如，在异基因移植小鼠模型中将B16黑色素瘤细胞和MSCs分开注射时，MSCs不但未能促进肿瘤的生长，反而产生了免疫抑制作用[19]。总之，MSCs在介导乳腺癌的耐药过程中既具有促进CAFs转化、上皮间充质转化、血管生成和肿瘤转移的作用，也具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖相关信号通路及免疫反应的作用。

1.2 乳腺肿瘤干细胞(Breast CSCs，BCSCs)

通过全基因组和单细胞RNA测序分析结果显示，在乳腺肿瘤中存在一组作为肿瘤起始的细胞，即BCSCs。这些细胞具有干细胞特性，可自我更新和维持肿瘤的发生，可作为乳腺癌细胞增殖、转移和化疗耐药的驱动力[20]。BCSCs与其微环境处于动态平衡状态，其表型受其周围细胞或间质细胞来源的细胞内/外因子调控。然而，这些具有“促干细胞特性”的细胞因子都是炎性细胞因子，如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和CXCL-5。另外，在BCSCs中还伴随有干细胞特性和自我更新相关信号通路的异常激活，例如Wnt、PI3K/Akt/FOXO、TGF-β和Notch[21-23]。值得注意的是，以上炎细胞因子及信号通路在BCSCs介导的耐药、肿瘤侵袭和转移中起着至关重要的作用。

1.3 CAFs

在乳腺癌微环境中存在大量CAFs，CAFs常来源于周围成纤维细胞，也可由其他类型的细胞分化而来，如MSCs、脂肪细胞、星状细胞等。其中，肿瘤中有相当比例的CAFs来源于骨髓源性-MSCs[20]。CAFs为正常成纤维细胞活化后的特殊细胞类型。在细胞表型和功能及遗传方面与正常成纤维细胞具有较大差异，并且很可能受到肿瘤微环境和及其起源的动态调控[24]。在乳腺癌的微环境中，正常成纤维细胞通过与白细胞或分泌因子(包括TGF-β、CXCL-12、成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子)直接接触后被激活为CAFs。激活后的CAFs能够促进血管生成、肿瘤增殖、EMT及转移，并降解细胞外基质释放的信号分子。CAFs可选择性表达血小板衍生生长因子受体、纤维活性蛋白及波形蛋白等，从而增强癌细胞的增殖和侵袭能力[25]。乳腺CAFs中还存在许多细胞增殖相关蛋白的异常表达，包括核糖体蛋白S6激酶、成纤维细胞生长因子受体、柚皮素和细胞周期素依赖性激酶抑制剂。

目前有研究发现，一些具有特定细胞表面分子的CAF亚群可促进乳腺癌的发生发展和耐药形成。例如，CD10+GPR77+CAFs可通过分泌IL-6和IL-8为肿瘤干细胞提供生存空间，促进肿瘤的形成和耐药[11]。也有研究表明，CAFs能够使癌细胞逃避化疗的细胞毒性作用。例如，在利用拉帕替尼治疗HER-2+乳腺癌的过程中，CAFs可通过产生肝细胞生长因子介导乳腺癌细胞耐药[26]。总之，CAFs与TME间的相互作用在乳腺癌的进展过程中发挥了重要作用，且与其预后不良有关[27-28]。

2 在乳腺癌化疗过程中MSCs/CAFs-BCSCs介导耐药的机制

2.1 MSCs与BCSCs介导的化疗耐药

在乳腺癌TME中MSCs可通过分泌IL-6和CXCL7细胞因子直接参与BCSCs的调控，促进乳腺CSCs自我更新和癌细胞增殖[20]。而且，此通路也与“干细胞”表型的诱导有关。另外，由于TME中MSCs易分化为CAFs，而CAFs可通过产生间质细胞衍生因子-1，促进表达间质细胞衍生因子-1受体的乳腺癌细胞增殖。其中，间质细胞衍生因子-1的表达状态与乳腺癌患者的预后密切相关。目前研究认为，MSCs通过分泌IL-6及产生间质细胞衍生因子作用于BCSCs的通路，可能是MSCs-CSCs介导乳腺癌耐药的机制[29]。此外，在细胞毒性药物作用下，MSCs对乳腺癌细胞的保护既需要分泌蛋白的参与，也需要细胞之间的相互作用。其中，MSCs通过分泌IL-6使乳腺癌细胞在化疗过程中产生耐药，并可促进ERα+乳腺癌细胞增殖[30]。例如，针对ERα+乳腺癌的细胞毒性药物(如紫杉醇、阿霉素)及抗HER-2+乳腺癌的赫赛汀，IL-6均能促使乳腺癌细胞对其产生耐药[31]。同时，乳腺癌细胞释放的IL-6可介导MSCs“归巢”进入肿瘤原发部位，与其受体相互作用诱导MSC分泌CXCL7。这些细胞因子共同参与形成影响CSCs的趋化因子网络，进而诱导针对抗癌药物耐药[32]。

除上述机制外，MSCs可通过分泌胞外囊泡介导耐药。这些囊泡含有miR-23b(即一种蛋白激酶C的细胞底物)，其抑制作用可导致BCSCs在TME中休眠，从而对紫杉醇产生耐药[33]。此外，也有报道称MSCs可作为药物的增敏剂。例如，MSCs可促进乳腺癌细胞对激酶抑制剂、阿霉素和5-氟尿嘧啶的敏感性[34]。与此同时，BCSCs也可通过细胞周期阻滞对MSCs发出的信号产生应答，并表现出更高的增殖活性[35]。因此，细胞周期阻滞也是癌细胞逃避细胞毒性药物作用的一种有效机制。上述研究表明，在乳腺癌的TME中MSCs与BCSCs的相互作用，是引起化疗耐药的重要途径。因此，这将成为改善治疗耐药的重要靶点。

2.2 CAFs与CSCs介导的化疗耐药

在乳腺癌TME中CAFs可通过旁分泌途径产生大量的前列腺素E-2(PGE-2)，增强IL-6的分泌，从而促进CSCs的增殖[36]。此外，当与癌细胞共同培养时发现，CAFs产生了较高水平的趋化因子(C-C基序)配体-2(CCL-2)。CCL-2可诱导Notch-1表达，促进CSCs增殖，从而激活Notch信号通路[37-38]。鉴于CAFs常通过分泌促癌旁分泌因子来调节CSCs，一些临床前研究开发了CAFs-CSCs旁分泌信号通路功能阻断的治疗，以改善对实体肿瘤的治疗。例如，在HER-2+乳腺癌中CAFs可通过介导PTEN的缺失或IL-6/STAT-3/NF-κB信号通路的激活，使乳腺癌细胞对赫赛汀产生耐药[31]。另外，此信号通路的激活可诱导乳腺癌细胞表达间质转化表型并增强其增殖能力。CAFs能通过分泌胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF)-1和IGF-2，使乳腺癌细胞产生化疗耐药并促进其转移。其中IGF-1和IGF-2在肿瘤细胞上激活胰岛素和IGF-1受体信号，从而诱导乳癌细胞对吉西他滨和紫杉醇耐药。抗IGF阻断抗体的治疗可增加乳腺癌细胞对化学药物的反应并减少转移的发生[39]。因此，用功能阻断性抗体(抗IL-6受体抗体)阻断该环节可有效地逆转上述表型的发生。

另一项研究中，研究人员在人源性异种移植乳腺癌模型中用抗IL-6和抗IL-8的抗体联合多西紫杉醇，抑制分泌IL-6和IL-8的CD10+GPR77+CAFs亚型，结果显示肿瘤几乎完全缓解[11]。同时，该研究还发现抗G蛋白偶联受体77(G protein-coupled receptor 77，GPR77)抗体联合多西紫杉醇的抗肿瘤效果与抗IL-6或抗IL-8联合多西紫杉醇的抗肿瘤效果相当，可显著降低CD10+GPR77+CAFs的数量和CSCs在治疗肿瘤中的比例。与IL-8在肿瘤干细胞特性中的关键作用相一致的是，针对其受体CXCR-1的功能阻断抗体或CXCR-1和CXCR-2的小分子抑制剂，可以在人类乳腺癌异种移植模型中消耗CSCs并降低肿瘤侵袭性。与临床治疗特别相关的是最近发现，在转移性乳腺癌的Ⅰb期研究中，CXCR1/2激活的抑制剂与紫杉醇联合应用有效率可达30%[40]。CXCR-2的其他小分子抑制剂，包括AZ13381758和SB225002，也在人源性异种移植乳腺癌模型中显示出临床前的疗效[41]。虽然大多数CAFs在基因上相对稳定，化疗耐药风险较低，但越来越多的证据表明成纤维细胞的保护作用可以促进癌细胞逃避化疗的细胞毒性效应。因此，CAFs也可能成为抗肿瘤药物的物理屏障，并降低其杀伤效果。

3 小结与展望

乳腺癌的耐药不仅取决于肿瘤细胞本身，还取决于微环境中各间质成分的介导作用。通过对肿瘤间质在乳腺癌治疗过程中介导化疗耐药的深入了解，将为突破此屏障带来机遇。目前，通过阻断CAFs来源的促干细胞因子的治疗和通过抑制MSCs分泌促干细胞因子或直接耗竭MSCs的研究，都尚处于临床前期或早期临床验证阶段。另外，通过阻滞CAFs和BCSCs之间的相互作用或拮抗其促肿瘤形成作用的研究，也将为下一代治疗提供希望。CAFs与MSCs的靶向治疗为增强放/化疗等细胞毒性疗法的治疗反应及防止治疗诱发BCSCs的扩增和激活均提供了新方向。此外，CAFs和MSCs的靶向治疗还可协同BCSCs靶向药物，共同降低乳腺癌的干细胞特性和侵袭性，最终提高乳腺癌患者的治疗效果。有趣的是，CAFs相关的生物标记物还有望为设计临床试验及指导患者选择CAFs-/MSCs-靶向疗法提供帮助。总之，这些新的针对间质细胞的抗肿瘤靶向疗法，将有望丰富此前的抗肿瘤治疗，开启乳腺癌治疗领域的新篇章。