生物3D打印在神经外科领域中的研究进展

张春声 李海燕 徐如祥 徐弢

生物3D打印技术代表着当前医疗及科研行业的重点发展方向之一，率先在骨科获得广泛临床应用，在神经外科、口腔、肝胆及肿瘤等科室领域内也已获得一定的探索应用，具体应用研究涵盖了医学模型、复杂组织工程支架制造、组织再生与修复、个性化肿瘤精准医疗模型以及高端植入类器械的制造等多个方面[1]。针对神经外科领域的研究，生物3D打印技术与临床已形成紧密结合，在手术治疗及前沿研究等方面均有深度融合。本文主要聚焦神经外科领域，根据神经外科中常见的专业分类，并结合国内外开展生物3D打印技术发展情况，探讨生物3D打印技术在神经外科领域中的发展和应用机遇，现综述如下。

一、生物3D打印技术概况

生物3D打印技术是指以加工生物材料、活性物质及活细胞等作为打印对象，经特殊的打印装置，按照设定好的程序运行后，所形成具有三维立体结构的类组织体，可广泛应用于细胞生物学、再生医学以及组织工程修复等领域[2,3]。对于神经外科临床科室，脑肿瘤、颅骨修补、神经和血管再生修复等研究一直属于热点，也是急需解决的重大民生问题，国内外已有很多团队结合生物3D打印技术在上述领域开展相关研究。

二、生物3D打印技术在国内外神经外科领域的研究现状

（一）脑肿瘤治疗领域

脑肿瘤已成为危害人类生命健康的重要肿瘤之一，全球发病率逐年升高。基于患者的影像数据，3D打印医学模型可用于辅助临床手术，缩短手术时间，提高手术成功率，目前在临床癌症治疗方面已有多方面研究报道。2015年，日本Mashiko等[4]和Kimura等[5]研究团队分别利用3D打印技术制作出医学3D打印血管模型，从颅内结构、材质以及手术入路方式等多方面高度仿真真实动脉瘤血管的解剖部位。2015年中国Tai等[6]研究团队开发出可用于脑室穿刺手术训练的教学培训的医学3D打印模型，并且为了用于降低材料成本，设计和打印上采用拆卸后再组装方式，辅助临床医师提高手术技能掌握。2016年，苏州大学附属第二医院兰青团队在国内率先使用3D打印全彩医学模型用于重构动脉瘤模型，辅助术前选择合适的手术器械以及最佳的手术入路方式，精准指导手术[7]。3D打印医学模型主要是在体外应用，在术前帮助医生和患者更加直接地了解病情或是辅助临床手术，提供更加精准的个性化手术治疗方案。3D打印医学模型具有多色彩、多材质等特点，便于临床观察以及仿真解剖结构，但是无法满足临床上对手术切除后缺损处的组织部位再生修复等方面的需求。

随着生物3D打印技术的不断发展，已逐渐形成结合临床需求和应用为出发点的再生修复和肿瘤领域内的研究。2018年，苏州大学附属第二医院和清华大学团队合作研究了生物3D打印技术在胶质瘤细胞模型、肿瘤微环境以及成血管化等方面进行研究，对比传统的二维细胞培养方式，研究证实生物3D打印后的肿瘤细胞在细胞增殖、分化、干性能力保持以及动物体内致瘤实验上均表现出明显的差异性，为脑肿瘤的发生机制及个性化药物精准治疗提供理论研究模型[8-11]。生物3D打印通过模拟肿瘤细胞生长的微环境，能够成功构建出具有三维立体结构的脑肿瘤模型，但是该模型中选取了细胞系作为研究对象，对于临床应用指导癌症患者用药方面，与患者肿瘤组织在生物学特性上存在一定的差别，难以实际反映患者的真实情况，无法真正指导临床。然而，2019年韩国Dong-Woo Cho研究团队在应用层面率先利用生物3D打印技术结合患者来源的原代细胞，成功构建了针对特定患者的个性化胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）芯片，将患者来源的肿瘤细胞、血管内皮细胞以及猪来源的脑组织脱细胞后的细胞外基质构建了具有同心环结构的肿瘤组织芯片，高度仿生模拟真实GBM组织特性，用于观察体外环境下放射、化学治疗对患者肿瘤芯片的细胞学行为变化，并对比临床观察不同患者对替莫唑胺同步放射、化学治疗的特异性反应，帮助评估不同药物组合方式对肿瘤患者的治疗效果，为临床方案的精准用药指导提供依据[12]。

（二）再生型颅骨修复

因交通事故、疾病发生等各种原因导致的颅脑创伤患者数量逐年升高，临床上颅骨修补产品种类多样，按材料划分以人工合成材料为主，其中包括硅胶、聚甲基丙烯酸甲酯、钛网、聚醚醚酮等，这些材料均为不降解材料，且具有一定的生物惰性，这些材料能够满足颅骨缺损处的修补，但是缺少生物活性，与自体骨之间骨融合性差，尤其对于小儿患者，无法满足颅骨再生的需求。因此，对于可再生型颅骨的研究具有一定的临床需求。据报道，2016年美国Atala团队通过对下颌骨缺损患者进行CT扫描并获取其影像数据后，采用生物3D打印技术，以人来源的羊水干细胞（human amniotic fluidderived stem cells，hAFSCs）和聚己内酯/磷酸三钙为打印原料，制备出3.6 cm×3.0 cm×1.6 cm可用于缺损处填充的生物活性个性化骨组织支架，体外培养1 d后，细胞存活率达到91%±2%，体外培养28 d后茜素红染色可观察到明显的成骨分化；通过打印出直径为8 mm、厚度为1.2 mm的圆块支架并复合hAFSCs植入到SD大鼠的颅骨缺损模型中，5个月后观察到支架内部有大量含血管的新生骨组织生成，而阴性对照和无细胞支架实验组仅能观察到纤维组织的长入[13]。2019年第四军医大学西京医院费舟团队利用动物自体骨瓣来源，经冷冻研磨处理成活性骨粒，并通过向材料中引入自体骨髓间充质干细胞，结合生物3D打印技术以不同填充率及层间角度基于影像学数据成功制备出具有可再生型功能的多元个性化颅骨修复支架，并对自体骨髓间充质干细胞在支架中的细胞增殖、存活率以及成骨分化相关基因等进行检测，并建立了兔颅骨缺损模型，评价支架植入新西兰大白兔体内后3个月后的成骨能力，可观察到大量新生骨组织。生物3D打印技术具有个性化设计、仿生定制等特点，一方面能够满足缺损部位形状的精准匹配实现结构仿生；另一方面，选择自体的生物活性物质作为打印原材料又可实现组分仿生，从而促进打印支架植入后的功能仿生[14]。

（三）神经组织再生

神经系统在机体内对生理功能活动的调节起主导作用，由于神经损伤的多样性和病例改变的复杂性，传统的神经康复治疗效果并不理想，功能恢复不佳。神经导管的制作方法比较多，包括模具法、编织技术、静电纺丝、溶剂挥发等多种方式，但是对于理想的神经导管构建要素应当考虑材料组分、模拟自体结构以及最佳的种子细胞等。生物3D打印技术能够适用于多种材料和细胞的打印，尤其在微观结构上能够实现更加精细的仿生制造。2016年四川大学华西医院苟马玲团队通过一种3D生物打印技术制备出可用于周围神经再生修复的神经导管。该生物导管由聚合的明胶甲基丙烯酰基（cryo gelat in methacryloyl，cryoGelMA）凝胶和脂肪来源的干细胞（adipose derived stem cells，ASCs）组成，通过使用3D打印的“锁和钥匙”模具进行建模，cryoGelMA凝胶被构设计多通道、分叉型以及个性化定制结构等具有不同几何形状的导管，体外实验以及植入到缺损长度为10 mm大鼠坐骨神经缺损处，发现cryoGelMA在体内2～4个月可完全降解，研究在术后不同时间点下大鼠模型的步行轨迹进行分析，证明cryoGelMA和ASCs实验组的生物导管具有较强的神经再生能力，在功能和组织学评估方面的结果更加接近自体移植物[15]。2017年日本京都大学的Hirofumi Yurie研究团队率先利用生物3D打印技术实现神经再生功能，通过采集人体皮肤提取成纤维细胞，培养出来细胞块，经生物3D打印制造出内径为2 mm，壁厚为500μm的筒状神经导管。通过实验鼠的对比实验发现，植入生物3D神经组织的实验鼠与健康实验鼠一样行走，并测量了老鼠的跖骨摆动、肌肉动作电位和神经细胞表达，研究表明完全由纤维细胞组成的无支架生物3D导管可以促进大鼠坐骨神经模型中的神经再生[16]。2017年5月，美国明尼苏达大学和普林斯顿大学等机构的研究人员发现首先利用3D扫描获得了小鼠坐骨神经的轮廓，然后再利用3D打印技术打造出了一个内含能够促进神经元再生的生长因子NGF或胶质细胞源性神经营养因子GDNF的硅酮类支架，通过手术将这种支架植入到缺损为10 mm的大鼠坐骨神经损伤处，经过10～12周的培养，大鼠受损的行动功能获得了明显改善，这一结果表明3D打印技术将在促进复杂神经元功能的恢复方面起到重要作用[17]。2019年美国Jacob Koffler团队应用生物3D打印技术，以PEG-GelMA为打印原材料，构建了具有白质和灰质结构的仿生大鼠脊髓模型，其中脊髓白质部分具有200μm孔径，灰质为实心固体结构，通过向支架中添加神经前体细胞后，观察移植后体内神经轴突再生和神经通路连通情况，发现受损的宿主脊髓再生的神经轴突生长进入到打印的仿生脊髓支架中，该方法构建的仿生脊髓支架可以实现受损部位星形胶质细胞与神经轴突的定向排列生长，为精准医学对脊髓神经再生修复提供了一种新的研究思路[18]。

（四）血管重建

全球心血管病患病率及死亡率呈逐年上升趋势，导致临床上对于人工血管的需求也日渐增多。理想的人工血管应当具有一定的力学强度、弹性以及植入后保持血管内部的通畅等特点。目前，大尺寸（直径≥6 mm）血管支架已在临床获得应用，常用的材料包括聚四氟乙烯、丝素蛋白、聚氨酯等，但是小尺寸（直径≤6 mm）血管，因植入后容易发生血栓以及血管内膜增生等使其在临床应用方面受到局限[19]。2014年，美国哈佛大学的Jennifer A.Lewis研究团队基于生物3D打印技术以GelMA为生物墨水制备出具有多通道结构的含成纤维细胞结构体，打印的多通道材料为F127，该材料具有在低温状态下呈现液态以及高温下固化等特点，打印完成后通过溶解去除其中的F127材料，使得结构体中富含大量的管状通道，通过向管道内壁中注入血管内皮细胞，细胞附着在通道内壁中自组装形成血管，该方法为血管化的多细胞组织研究提供了一种策略[20]。2019年Miller JS研究团队利用光固化生物3D打印技术构建了内部含有丰富复杂血管网络的水凝胶块，通过向通道中分别灌注氧气与脱氧红细胞，实现对红细胞的供氧仿生模拟人体肺泡结构；其中最小的血管直径为300μm[21]。人体组织中常含有丰富而密集的血管网络，主要是为组织内的活细胞提供氧气以及营养物质输送，所以血管化是组织工程与再生医学领域中的一个关键问题，对于器官打印，尤其针对大块组织的修复至关重要。目前，所制造的活性组织太小，制造用于器官修复或替换的大型组织，需要制造高细胞密度结构体以及血管化通道。2019年，Jennifer A.Lewis研究团队再次在血管化组织研究方面取得突破进展，研究发明SWIFT技术选用特异性诱导多功能干细胞并使用大规模的微孔阵列聚集形成高密度细胞团的器官堆积体OBBs，通过与Ⅰ型胶原和基质胶在0℃～4℃下混合离心形成高密度的细胞聚体，并使用生物3D打印技术在高密度细胞聚集体中构建网络通道，去除打印通道的材料进行灌注，从而在致密基质内部形成血管通道，并且这些通道的直径范围为400μm～1 mm[22]。该打印方法模拟了具有循环通道的高细胞密度和带血管化厚实组织的构建，进一步接近组织修复和再生的活体结构。

三、总结与展望

针对神经外科研究领域的脑部肿瘤治疗，通过建立脑肿瘤模型研究微环境变化下肿瘤的细胞行为学、肿瘤-血管发生机制等；在颅骨、神经以及血管等组织再生方面，尤其是在个性化定制、复杂或精细的组织结构，可实现组织修复的结构仿生；同时，生物3D打印技术能够满足活细胞以及活性物质等作为打印材料，通过选用不同的生物材料以及细胞类型或配比等实现组分仿生，进而对功能进行调控，实现最终的功能仿生。目前，基于生物3D打印技术在体外三维组织或器官模型、模拟病理微环境以及药理模型等方面已经有很大研究，未来有望为再生医学、肿瘤治疗研究、新药研发等领域的研究及产业转化带来更多机遇。