曲霉菌对唑类药物的耐药机制最新研究进展

刘登科，牛虹博，葛正茂，刘宇鹏

（中国人民解放军联勤保障部队第967医院ICU，辽宁大连 116000）

曲霉菌在自然界中分布广泛且种属众多，在湿润的土壤、谷类中都可存在[1-2]。其本身为条件致病菌，正常情况下不致病，但是当人体免疫功能下降时，即可侵入人体，造成侵袭性曲霉菌病（invasiveAspergillosis,IA）[3]。因为IA的死亡率高、早期诊断率低[4-5]，所以针对曲霉菌的杀菌药物就显得尤为重要。目前，治疗曲霉菌感染常用三类抗真菌药物：多烯类、唑类和棘白菌素[6]，其中伏立康唑（voriconazole，VRC）被美国的最新指南推荐为曲霉菌病的一线治疗药物[7]。但越来越多的研究显示，曲霉菌在世界范围内对于唑类药物的耐药率逐渐升高，给临床治疗带来极大困难，严重威胁了病患的生命安全[5-6]。由于多烯类药物具有较强的毒性，棘白霉素类药物的价格较为昂贵，因此唑类药物是治疗曲霉菌感染的一线药物[8-9]，因此本文就曲霉菌对唑类药物的耐药机制的最新研究进展进行简要阐述，以期为曲霉菌耐药菌株的监测以及新型治疗药物作用靶点的研制提供理论基础。

1 曲霉菌对唑类抗真菌药物的耐药机制

1.1 外排系统过表达将抗菌物质泵出菌体外 外排系统的过表达是曲霉菌对唑类药物产生耐药性的一种重要机制，相关作用基因主要是三磷酸腺苷结合盒蛋白(ATP - binding cassette transporter，ABC) 超家族和主要协同转运蛋白(the major facilitator superfamily，MFS)超家族[10]。有关文献显示，酿酒酵母的PDR5和PDR15蛋白参与了酿酒酵母对唑类药物的耐药，而CHAMILOS等[11]人在烟曲霉中发现的12个ABC转运蛋白与酿酒酵母的PDR5和PDR15蛋白同源，提示人们ABC转运蛋白可能与烟曲霉对唑类的耐药相关。到目前为止，已知的与耐唑相关的转运蛋白有5个：AfuMDR1，AfuMDR2，AfuMDR3，AfuMDR4和AtrF。AfuMDR1和AfuMDR2 是最早被报道的ABC转运蛋白，直接参与了烟曲霉对药物的外泵作用[12]，而AtrF则是分离自对伊曲康唑(itraconazole，ITC)耐药的临床烟曲霉株，对ITC耐药株中AtrF mRNA的表达水平是对ITC敏感株的5倍[13]。还有报道表明，对ITC耐药菌株中转运蛋白AfuMDR3和AfuMDR4的表达上调[14]；对泊沙康唑（posaconazole，POS）耐药烟曲霉株中AfuMDR4 的表达上调[15]。MFS与AfuMDR3具有相似性，SUN等[16]人通过研究发现，MFS转运蛋白Mdr1p可以通过细胞膜的质子梯度为转运体提供能量，其过表达可导致曲霉菌对唑类药物耐药性的产生。然而，关于曲霉菌外排系统过表达将唑类药物泵出菌体外的机制尚未研究透彻，还需要进一步详细的研究。

1.2 曲霉菌生物膜的产生 曲霉菌的耐药性可以通过生物膜的产生来调节，生物膜不仅可以在恶劣环境中保护病原体，还能引起暂时性的对抗真菌药物的耐药性[17-18]。此前MOWAT等[19]人在培养曲霉菌时发现其形成的生物膜结构对抗真菌药物具有耐药性，随后BEAUVAIS等[20]人则报道了烟曲霉菌落表面的细胞外基质的作用。他们认为烟曲霉细胞外基质有助于菌丝结合在一起形成生物膜结构，阻止药物扩散到真菌感染部位，从而降低了药物敏感度。PAUL等[17]人也认为生物膜的形成是曲霉菌对抗真菌药物的高最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的原因。此外，在生物膜结构中，多种耐药蛋白被激活，也可通过主动外排系统泵出抗真菌药物[15]。生物膜有关感染的死亡率极高，现有药物治疗难以治愈，因此对生物膜在耐药性中的研究十分重要。

1.3 曲霉菌自身基因的改变

1.3.1 cyp51的突变与过表达：目前常用的抗真菌药物的作用机理主要是通过干扰麦角固醇的生物合成来影响真菌细胞膜的形成[21]。自1997年首次报道烟曲霉唑类耐药菌株以来，越来越多的人对其耐药分子机制进行了探讨[22]。在烟曲霉属中，唑类药物的目标是蛋白cyp51，它有两个同源的基因编码，即cyp51A和cyp51B，其序列一致性为63%，相关研究表明，大多数烟曲霉唑耐药株的出现都与cyp51A的点突变有关[23]。在烟曲霉菌中羊毛甾醇 14-α-脱甲基酶由cyp51A编码，是真菌细胞膜重要成分麦角固醇生物合成途径的关键酶。唑类抗真菌药中的氮原子可以结合位于cyp51A活性位点的血红素的铁原子上。通过这种方法，可以阻断羊毛甾醇第14位碳原子的脱甲基作用，从而干扰麦角固醇的合成。缺乏麦角固醇会改变细胞膜的流动性，导致真菌细胞的死亡[5,24]。

如前所述，大多数耐唑类菌株cyp51A发生了改变，而cyp51B在烟曲霉耐唑类药物菌株中的作用尚不清楚。近年来，也有相关研究报道了cyp51B在唑类耐药临床分离菌株中的作用[25]，BUIED等[26]人在所分离得到的12株烟曲霉临床耐药菌株中均发现了cyp51B的过表达。随后他们对cyp51B过表达的菌株进行了基因敲除，又对唑类药物敏感的菌株进行了cyp51B的过表达，验证了cyp51B的过表达与曲霉菌对唑类药物的耐药有关这一发现。

1.3.2 hapE的突变：hapE是CCAAT结合转录因子复合物亚基，hapE的突变所引起的烟曲霉对唑类药物耐药是近年来发现的一种基因突变所致的耐药机制[27]。这一发现由CAMPS等[28]人于2012年发现并提出，他们通过全基因组测序、聚合酶链式反应等多种方法证明了hapE中P88L的替换是导致烟曲霉对唑类药物耐药性产生的原因。hapE的突变会引起其与CCAAT复合物之间的亲和力变低，而减少了功能性CCAAT结合转录因子复合物后又会造成曲霉菌致病力的减弱。GSALLER等[29]人进一步研究发现，CCAAT结合转录因子复合物作为调控麦角固醇合成的负作用因子，若其减少，将会解除包括cyp51在内的多种关于麦角固醇合成的基因转录水平的抑制，造成麦角固醇的增多和耐药菌株的产生。

1.4 环境对耐药株的产生和传播 此外，环境对耐药株的产生和传播作用也不可忽视。多种唑类杀菌剂广泛用于农作物的保护，这些唑类杀菌剂的分子结构与三唑类药物相似，但曲霉菌并不是在农业中使用杀菌剂的目标病原体，曲霉菌在自然界分布广泛，土壤、作物中都有其孢子的存在，因此用杀菌剂处理过的作物上的真菌暴露于高浓度的唑类物质中[5]，导致了耐药株的产生和传播[5,22,30]。截至目前，欧洲是烟曲霉对唑类药物耐药性最高的地区，其中基因型为TR34/L98H，TR46/Y121F/T289A的耐药菌株已在欧洲各地发现，且被报道与农业杀菌剂的广泛使用有关[22,31]。虽然对亚太地区报告表明，其三唑耐药率低于欧洲，但也出现了部分新型耐药菌株[30,32]，亚太地区和欧洲曲霉菌唑类药物耐药率的差异可能是由于亚洲国家对唑类杀菌剂的使用较少所致[5]。

1.5 其他作用导致的耐药性的产生 热休克蛋白90 (heat shock proteins90，Hsp90)是一种真核分子伴侣蛋白，可以在环境作用下调控蛋白的折叠、运输和成熟[33]。钙调神经磷酸酶不仅是Hsp90的沉默蛋白之一，还是钙信号通路的重要组成部分，在对唑类药物的耐药性中也发挥着一定作用。有关实验发现，抑制了钙调神经磷酸酶后，烟曲霉对唑类药物的耐药性也随之下降[5,9]。

外源性胆固醇在有氧条件可以作为麦角固醇的替代物，也是一种导致曲霉菌对唑类药物产生耐药的机制。体外实验发现当培养基中存在胆固醇血清时，伊曲康唑对烟曲霉的作用活性降低[34]。另有研究发现，在烟曲霉中，一种固醇调节元件结合蛋白-SrbA可以通过erg11，cyp51A调节菌株对唑类药物的耐药性，而srbA的突变菌株(ΔsrbA)对氟康唑（Fluconazole，FLC）和VRC表现出高度敏感[35]。

2 讨论

近年流行病学调查发现，曲霉菌感染率正呈逐年上升趋势，再加上曲霉菌感染诊断率低，死亡率高的特点，对人类社会的健康造成了极大威胁[4-5]。目前，治疗曲霉菌感染常用三类抗真菌药物：多烯类、唑类和棘白菌素[6,9]。其中，唑类药物广泛用于曲霉菌感染的预防、经验性治疗以及慢性真菌感染的长期保守治疗，其中VRC被推荐用作曲霉菌感染的一线治疗方案[6-7,21]。但在过去的几年间，世界各地均有烟曲霉对唑类药物产生耐药性的报道，且报道数量仍在不断增加，所以对曲霉菌进行耐药率和耐药机制的研究就显得尤为重要[9,21]。因此，对于以上情况，本文给与以下建议：由于抗菌剂在农业生产中的大规模使用，使得每个国家都应密切关注并调查最新耐药株的流行情况，并依据调查结果在耐药株发生率高的地区积极调整治疗方案。实验室则应对临床曲霉菌分离株进行常规药敏试验，以便临床医生选择最佳的抗真菌治疗方案。而对于正在进行单唑类抗真菌药物治疗的患者，需进行密切监测，当发现唑类耐药、临床治疗失败时，应迅速调整新的治疗方案，使之包括两性霉素B，或在VRC中加入一种棘皮菌素。总的来说，有效的抗真菌管理对于控制耐药性的产生至关重要，本文针对曲霉菌对唑类药物的耐药机制的最新研究进展作了简要阐述，以期为曲霉菌耐药菌株的监测以及新型治疗药物作用靶点的研制提供理论基础，但耐药性的研究是项大工程，仍有许多机制不够明确，需要人类进一步探究。