乳腺癌患者血清长链非编码RNA ATB表达水平检测及临床诊断价值

洪 宏，袁建芬，喻海忠

（南通市中医院检验科,江苏南通 226001）

近年来，乳腺癌的发病率及死亡率逐年增高，严重威胁女性的身心健康[1]。目前，临床上常用的肿瘤标志物CA153特异度和灵敏度均不高，容易出现误诊及漏诊,且单项肿瘤标志物的检测在辅助诊断中有一定的局限性[2]。长链非编码RNA-ATB (long non-coding RNA-ATB，lncRNA-ATB) 在多种恶性肿瘤组织或血清中异常表达，但在乳腺癌外周血表达水平的研究较少，且表达情况较传统标记物CA153对乳腺癌的诊断价值也未见报道。本研究旨在对研究对象血清中lncRNA-ATB表达水平进行检测，并探讨联合检测CA153模式在乳腺癌诊断中的价值，现详细报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年6月～2019年9月期间收治的乳腺癌患者37例，同期乳腺良性疾病患者30例及健康体检者26例作为研究对象。乳腺癌组纳入标准：病理检查确诊为乳腺癌，排除曾进行化疗或放疗、肝肾功能异常、过敏者等，年龄38～79岁，平均年龄51.2岁。乳腺良性疾病组为同期收治患者，年龄46～72岁，平均年龄53.2岁。另健康组为女性体检者，均无肝肾、心血管及乳腺等疾病，年龄43～76岁，平均年龄52.4岁。各组在年龄、性别上差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 试剂和仪器 Trizol（Invitrogen 美国），TakaRa PrimeScript RT reagent kit，SYBR Premi ExTaq kit（大连宝生物工程有限公司），lncRNAATB及内参引物（上海生工生物工程有限公司）。Cobas z 480实时荧光定量PCR仪(Roche 瑞士)，Cobas e 411电化学发光仪(Roche 瑞士)，CA153试剂及质控品均为原装配套试剂。

1.3 方法 术前空腹抽取静脉血3 ml，1 h内于4 ℃条件下，以12 000 g离心力离心10 min分离血清，用Trizol法提取血清中的总RNA。分光光度仪A260nm/280nm检测吸光度，1.8～2.2 合格，进行下一步逆转录反应，按照TakaRa PrimeScript RT reagent kit试剂盒说明书操作，生成的cDNA置于-70 ℃保存。采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测血清lncRNA-ATB及内参基因GAPDH表达水平。lncRNA-ATB上游引物：5’-TACAACCACTGCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’ 反应体系为：cDNA 2 µl，上下游引物各1 µl，SYBR 10 µl，H2O 6 µl，共20 µl；反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，40个循环，溶解曲线1个循环。用2-△△Ct表示lncRNA-ATB的相对表达含量。用罗氏Cobas e 411型电化学发光仪检测CA153。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，首先用Kolmogorov-SmirnovZ检验进行正态性检验，呈非正态分布，用M(P25，P75)表示。多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，两组间比较采用非参数Mann-WhineyU检验。联合诊断采用二元Logistic回归分析，受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)，灵敏度和特异度评价指标的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组lncRNA-ATB相对表达水平比较 1ncRNAATB在乳腺癌组[1.82(1.19，3.74)]、乳腺良性疾病组[1.13(0.92，1.31)]和健康对照组[0.98(0.83，1.14)]血清中的表达水平差异有统计学意义(H=29.45，P＜0.01)。乳腺癌组血清lncRNA-ATB表达水平明显高于乳腺良性病组(U=233，P＜0.01)和健康对照组(U=131，P＜0.01)，差异有统计学意义。

2.2 血清CA153含量和lncRNA-ATB相对表达量单独与联合检测对乳腺癌的诊断价值 见图1。结果显示，lncRNA-ATB灵敏度为89.2%，特异度为67.9%，AUC为0.824（95%CI：0.735～0.914，P＜0.01），其临床诊断临界值（cutoff value≤1.104），而CA153灵敏度仅为67.6%，特异度为91.1%，AUC为0.809（95%CI：0.712～0.906，P＜0.01）。再以lncRNA-ATB，CA153为自变量，建立Logistic回归模型，通过模型中的概率值来拟合联合检测的ROC曲线，CA153和lncRNA-ATB联合检测的灵敏度提高至83.8%，特异度为80.4%，AUC为0.876（95%CI：0.800～0.953，P＜0.01）。

3 讨论

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，能通过表观遗传、转录及转录后的调控等方面影响相关基因的表达，参与染色体修饰、基因沉默、转录激活等，与肿瘤的发生、发展相关，其表达异常影响着肿瘤细胞的生物学行为[3-4]。由于不具有编码蛋白质的潜能，曾被认为是无用RNA或转录噪声[5]。lncRNA-ATB全称lncRNA actived by TGF-β,长度约为2.4kb,位于人类第14号染色体上，是首个被发现的能被转化生长因子激活的长链非编码RNA[6]。lncRNA-ATB在多种肿瘤中异常表达，是肿瘤发生、发展过程中的关键调控分子[7-9]。lncRNAATB在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌患者组织中及SKBR-3细胞系中呈高表达，其机制为lncRNA-ATB通过ceRNA结合miR-200c上调ZEB1和ZNF127的表达，高表达的ZEB1/ZNF127促进肿瘤细胞发生EMT和对曲妥珠单抗的耐药，下调lncRNA-ATB可以显著抑制SKBR-3细胞的生长,同时可促进曲妥珠单抗耐药的SKBR-3细胞凋亡[10]。

本研究显示，乳腺癌患者血清中lncRNA-ATB表达水平显著高于乳腺良性疾病者和体检健康者，提示lncRNA-ATB可能扮演着癌基因的角色，检测乳腺癌患者血液中的循环核酸，lncRNA-ATB可能为乳腺癌辅助诊断的一个潜在的分子标志物。ROC曲线显示，以lncRNA-ATB相对表达的临床诊断临界值（cutoff value≤1.104）用于诊断乳腺癌的灵敏度为89.2%，特异度为67.9%，AUC为0.824，与传统标志物CA153的灵敏度仅为67.6%，特异度为91.1%，AUC为0.809相比，灵敏度有提高，特异度略低，但诊断价值较高。进一步通过建立Logistic回归模型，模型中的概率值来拟合联合检测的ROC曲线显示，联合检测的灵敏度提高至83.8%，特异度为80.4%，AUC为0.876。联合检测诊断乳腺癌的效能优于单独检测，联合诊断可提高诊断的准确性，但要注意假阳性问题。

综上所述，lncRNA-ATB在乳腺癌患者血清中呈现高表达，在乳腺癌诊断中敏感度高，与传统标志物CA153联合检测弥补了单一指标检测的不足，可考虑为乳腺癌辅助诊断的一种潜在生物学标志物用于临床，以减少漏诊。不足之处在于本研究纳入的病例数有限，诊断价值仍需大样本进一步验证，缺少对乳腺癌术前、术后的比较、与临床病理特征的相关性及治疗疗效的观察等方面的研究，在后续工作中将通过随访、功能研究等进一步验证lncRNA-ATB的临床应用价值。