郁金香鳞片组培技术初探

刘君，米敏，郭方其，王骄阳，黑银秀*

(1.台州市农业科学研究院，浙江 台州 3170002； 2.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021)

郁金香(TulipagesnerianaL.)是世界著名花卉，近年来郁金香展蓬勃发展，每年从荷兰进口的郁金香品种和数量急剧增长。2019年仅江苏省就从国外引进300多个品种、3 000万粒郁金香种球用于郁金香文化月花海布置[1]。国内花展用球几乎都从国外进口，造成大量外汇流失。

通过传统分球方法进行郁金香种球繁殖，繁殖系数较低且品种易退化[2]，而以郁金香鳞茎、花茎及其他材料为外植体，通过组织培养技术进行郁金香种球的快速繁殖，不仅能保持原品种的优良特性，且繁殖系数高，是郁金香种球产业化繁育的重要手段。国外对郁金香组织培养的研究较多，主要以茎段[3-4]、腋芽[5-6]、球茎[7]、花茎[8]等作为外植体，且大部分研究都是先形成愈伤组织再分化出小芽。国内快繁研究多以鳞茎作为外植体，以直接诱导分化小鳞茎或小芽为主，研究方向主要集中在环境调控、激素配比筛选上，但繁殖系数不高，还未能在实际生产中应用[9]。本研究以郁金香鳞茎为外植体，研究不同取材时间、不同层鳞片诱导再生小鳞茎的效果，以期为郁金香的快速繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试郁金香品种为法国之光(Iie de France)，2018年12月至次年3月在台州市农科院小溪基地种植，4月采收种球，经消毒风干后置于温度(20±2) ℃、湿度(60±5)%的贮藏室存放，9—11月在5 ℃冷库存放。

1.2 消毒方式

挑选无病害郁金香种球，清理干净并剥掉外层褐色种皮，用自来水冲洗5 min，于超净工作台上预备消毒。除进行消毒方式筛选试验外，其他试验消毒方式均采用75%酒精浸泡2 min取出，用无菌水冲洗2次及2%次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡20 min后取出，再用无菌水冲洗3次。

1.3 接种、培养与统计

将郁金香鳞片切成5～8 mm小块进行接种。采用MS基本培养基，含3%蔗糖和0.45%琼脂粉，不同处理添加不同浓度激素，pH值调为5.8。每处理接8～10瓶，每瓶接4个外植体。培养条件为光照12 h·d-1，温度(25±2)℃。观察记录鳞片生长情况，1周后统计污染情况，30 d后统计诱导分化结果(不计污染，下同)。

1.4 试验方法

1.4.1 不同消毒方式对郁金香鳞片污染率的影响

2019年2月18日，田间郁金香处于蕾期，采挖种球进行试验。试验设3个消毒处理。T1为75%的酒精浸泡1 min，用无菌水冲洗2次，2%NaClO浸泡10 min，用无菌水冲洗2次。T2为75%酒精浸泡2 min，2%NaClO浸泡20 min，其他方式同T1。T3为75%酒精浸泡2 min，5%NaClO浸泡10 min，其他方式同T1。

1.4.2 不同层鳞片分化的差异

2019年3月27日田间植株处于更新球膨大期，取平均周径大于10 cm的更新球作为试验材料。该阶段更新球外面仍包着一层老鳞片，老鳞片干皱不饱满。试验设4个处理，从外向内分别取更新球的不同层鳞片，即外层鳞片(第1层)(后期会形成膜质种皮保护种球)、中层鳞片(第2层)、内层鳞片(第3层)、中心芽体(第4层)。将鳞片切成0.5 cm见方，凸面朝上接种到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培养基中。

1.4.3 带有底盘的鳞片的分化情况

2019年7月31日，室内贮藏的郁金香种球已完成花芽分化，取平均周径大于10 cm的种球作为试验材料，此时种球最外层鳞片已完全褐化变为膜质外皮。该试验设3个处理，从外向内分别取中层鳞片(第2层)、内层鳞片(第3层)、中心芽体(第4层)进行接种。将不同层的带有底盘结构的鳞片接种到6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1的MS培养基上。

1.4.4 小鳞茎的增殖情况

将试验中诱导得到的小鳞茎转接到6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的MS培养基上进行培养，观察小鳞茎的生长和增殖效果。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式对郁金香鳞片成活的影响

由表1可见，随着消毒时间的增加和NaClO浓度的升高，污染率逐渐降低。T3的鳞片污染率为10.17%，明显低于T1和T2。但经T3处理消毒的鳞片，培养4周后部分鳞片边缘由乳白色变成为褐色，并逐渐死亡，可能是高浓度的NaClO对鳞片组织造成损伤。为了提高后期成活率，建议使用T2处理对郁金香鳞片进行消毒。

表1 不同消毒方法对郁金香鳞片接种污染率的影响

2.2 不同层鳞片对愈伤诱导和小鳞茎再生的影响

培养2周后调查发现，第1层鳞片开始膨大，并由白色转为淡黄色，培养4周后，中心颜色变绿，边缘变褐，60 d后没有转接的愈伤组织边缘变黑直至死亡。表2表明，随着接种鳞片部位由外向内选择，愈伤组织诱导率逐渐减小，而小鳞茎诱导率逐渐增大。第1层鳞片即外层鳞片的愈伤诱导率高达88%，但未诱导出小鳞茎；第2层鳞片的大小和组织结构没有变化。第3和4层鳞片诱导小鳞茎效果明显，其小鳞茎诱导率分别为25.00%和57.89%(图1)。

表2 不同层鳞片对愈伤诱导和小鳞茎再生的影响

A、B、C、D分别为郁金香第3、4、1和2层鳞片培养4周后诱导出的小鳞茎和愈伤组织。图1 不同层鳞片诱导分化出的愈伤组织和小鳞茎

2.3 带有底盘的鳞片的分化情况

培养4周后调查发现(表3)，与2.2试验结果一样，第2层鳞片组织基本没有变化，既没有诱导出愈伤也没有诱导出小鳞茎。与2.2试验不同的是，无论第3层鳞片还是第4层鳞片都没有诱导出愈伤组织，但出现了很多绿叶组织(图2)。第4层绿叶和小鳞茎诱导率都显著高于第3层鳞片，其中叶片诱导率为31.67%，小鳞茎诱导效果更明显，诱导率高达73.33%。

表3 不同层鳞片诱导产生愈伤组织及小鳞茎的比较

A、B为郁金香第4层鳞片培养4周后诱导出的小鳞茎；C、D为郁金香第4层鳞片培养4周后诱导出的绿叶组织。图2 带有底盘的不同层鳞片诱导分化出的小鳞茎和绿叶组织

2.4 小鳞茎的增殖情况

2019年7月31日将带有郁金香小鳞茎的愈伤组织转接到MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培养基。图3是转接之前和转接4周后的增殖效果。由图可知，转接后芽显著增大、增多，增殖系数高达30，表明该培养基配方适合小鳞茎增殖。

E、F分别为郁金香鳞片转接前(7月31)和转接4周后(8月27)。图3 小鳞茎增殖和生长情况

图4是7月31日内层鳞片在MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培养基上进行离体培养诱导得到的小鳞茎，并于10月10日、12月11日、1月20日在MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培养基上进行转接，小鳞茎颜色浓绿、健壮、数量增多，生长状态良好，表明该配方适合小鳞茎生长。

A、B、C分别为12月20日、1月22日和2月27日拍摄。图4 小鳞茎生长情况

3 小结与讨论

本研究结果表明，选用75%酒精2 min+2% NaClO 20 min对郁金香鳞片进行消毒的效果最佳，鳞片污染率为15%。郁金香组培研究[10-13]多选用0.1%HgCl2对外植体进行消毒，本文选用低毒的NaClO进行尝试，且消毒效果较好，这为今后郁金香组培提供了一定技术参考。

本研究中不同层的鳞片诱导效果差异显著。随着由外向内进行鳞片接种，其愈伤组织诱导率逐渐减小，而小鳞茎诱导率逐渐增大，这与胡新颖等[11]的研究结果趋势相同，但诱导率远高于其试验结果。胡新颖等[11]研究表明，中层鳞片易诱导成愈伤组织，诱导率为8.0%；内层鳞片较易直接诱导生芽，再生率达26.7%。本研究中，外层鳞片愈伤诱导率高达88.00%，内层小鳞茎诱导率高达57.89%。进一步分析发现，本研究中鳞茎取材时间是3月，此时正处于更新球膨大期，而胡新颖等[11]选自荷兰进口种球，此期一般已完成花芽分化，这可能是二者诱导率不同的主要原因。因此，不同取材时期等因素对郁金香组织培养的影响也是接下来的研究重点。

本文中两个不同时期取材得到的诱导效果有显著差异。2019年3月27日田间郁金香处于更新球膨大期，该阶段取材的更新球外面仍包着一层老鳞片，但老鳞片干皱不饱满。2019年7月31日外植体取自收获后的种球，这一时期郁金香鳞茎内的花芽分化已经完成。鳞茎膨大期的鳞片可直接诱导出愈伤组织和小鳞茎，花芽分花后期的鳞片可诱导出小鳞茎和绿叶组织，说明鳞茎的取材时间和发育状态对小鳞茎的诱导结果不同。由此可见，外植体取材部位和取材时期的选择可能是影响诱导出愈伤组织还是直接诱导小鳞茎的关键因素。

本试验中选用带有底盘的不同层鳞片作为外植体，内层鳞片的基部可直接诱导出小鳞茎，诱导率高达73.33%。同时发现，有的鳞片可直接诱导出小鳞茎，而部分鳞片则同时诱导出小鳞茎和绿色叶片，该现象在其他文献中未见报道。小鳞茎在6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1培养基上颜色浓绿、生长健壮、数量增多，说明该配方比较适合小鳞茎的增殖。

对鳞片直接诱导产生的组织的称呼多有不同，有称为再生小鳞茎[10，13]、再生芽[11]或不定芽[12]。本文中发现由鳞片直接诱导出的该组织由底部膨大发白的鳞片和上部伸长呈绿色管状的芽组成，该结构与郁金香鳞茎基部外侧长出来的小鳞茎极为相似，因此，本文称其为小鳞茎。