胎菊水提物对大肠杆菌的抑制作用及应用

费 鹏 邢 敏 焦超芹 杨宝鑫 胡新颖邵安冉 芦 淋 康怀彬 郭 鸰

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

大肠杆菌(Escherichiacoli)又称大肠埃希氏菌，是一种革兰氏阴性、无芽孢、兼性厌氧的食源性条件致病菌，广泛存在于蔬菜、水果、外界环境以及牛肉、鸡肉、牛奶等动物源食品中[1-2]。该微生物为条件致病菌，一般条件下不致病，但某些特殊血清型的大肠杆菌可引起人或动物呕吐、腹泻、败血症等，严重者可导致患者死亡[3]。目前，关于大肠杆菌污染食品及加工环境的报道已被大量报道[4-7]，因此，如何有效预防和控制大肠杆菌对食品的污染是亟待解决的问题。

人们常在食品的运输、加工等过程中添加化学合成防腐剂以抑制或杀灭病原微生物来延长食品的货架期，保证食品质量[8]。但随着食源性致病菌耐药性的增强及化学防腐剂对人体健康造成的不良影响，使得越来越多的研究者开始倾向于利用植物源活性物质作为天然的抑菌剂发挥杀菌功效[9-10]。胎菊是杭白菊上品的一种，富含挥发油类、酚类、黄酮类化合物等活性成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、降血压等生物活性[11]。黄涵年[12]通过牛津杯法测定了杭白菊总黄酮提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果，结果表明杭白菊总黄酮提取物对4种供试菌均有一定的抑制作用。吕都[13]发现杭白菊挥发油对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌均有一定的抑菌活性，其最小抑菌浓度为0.325%～1.300%。上述研究表明胎菊提取物对食源性致病菌具有一定的抑菌效果，然而，其可能的抑菌机理和应用并未被深入挖掘。

研究拟以大肠杆菌为供试菌株，以水为溶剂对胎菊进行提取，并评估胎菊水提物对大肠杆菌的抑菌效果；通过检测胎菊水提物对大肠杆菌生长曲线、胞内ATP浓度、膜电位、细胞形态的影响揭示其可能的抑菌途径；将胎菊水提物应用于熟猪肉的保藏中，以期为开发一种新的天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胎菊：艺福堂菊博士胎菊，产自浙江省桐乡市胎菊生产基地，80 g，洛阳大张超市；

猪肉：试验所用猪肉为当天屠宰的猪的冷鲜里脊肉，洛阳大张超市；

大肠杆菌(Escherichiacoli)O157：东北农业大学食品学院菌种库；

大肠杆菌分离菌株2020-1、2020-2、2018-4、2018-5、2020-3、2019-8：分别从牛肉、鸡肉、黑芝麻糊及设备表面分离得到；

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soya agar，TSA)、溶菌肉汤培养基(Luria-Bertani，LB)：青岛海博生物有限公司；

乙醇、戊二醛、饿酸、氢氧化钠等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

ATP试剂盒：碧云天生物科技有限公司；

十二烷基琥珀酸酐、DiBAC4(3)荧光探针：索莱宝生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

精密电子天平：Pl203型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

生物超净工作台：Bcn-1360型，上海佳胜仪器制造有限公司；

离心机：GL-21M型，上海市离心机械研究所；

电热恒温培养箱：DHP-9272型，上海一恒科技有限公司；

高压蒸汽灭菌锅：LDZY-50kB-Ⅲ型，上海申安医疗器械厂；

多功能酶标仪：Tecan Infinite 200 PRO型，北京普天新桥技术有限公司；

紫外分光光度计：DU-800型，美国Beckman公司；

透射电镜：H-7650型，日本日立公司；

色差计：Color meter ZE 6000型，上海过望化工有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胎菊水提物的制备 参照张赟等[14]的方法。将胎菊粉碎成粉，过82目筛，以水为溶剂，在70 ℃、料液比(V水∶V胎菊)为1∶30 (g/mL)的条件下浸提80 min，收集滤渣，并在相同条件下重复浸提2次，合并所有滤液，40 ℃ 旋转蒸发进行浓缩以得到胎菊水提物浓缩液，最后使用真空冷冻干燥装置将其干燥成粉末，冰箱冷藏备用。

1.3.2 受试菌株 参照吕都[13]的方法对大肠杆菌O157和其他5株大肠杆菌进行活化，上述6种菌均用于胎菊水提物抑菌活性的评估中，而大肠杆菌O157用于抑菌机理的探索和熟猪肉保藏的应用。

1.3.3 抑菌圈直径(DIZ)的测定 采用牛津杯法[15]。无菌条件下吸取100 μL浓度为107CFU/mL的菌悬液并涂布在TSA平板上，将3个无菌牛津杯均匀地插入培养基，并向每个牛津杯中加入200 μL浓度为10 mg/mL的胎菊水提物溶液，在37 ℃下培养24 h后测量抑菌圈直径。抑菌圈直径大小所代表的含义为：直径>20 mm，表示菌种对抑菌剂极敏感；15～20 mm为高度敏感；10～14 mm 为中度敏感；7～9 mm为低敏；<6 mm为不敏感[16]。

1.3.4 最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)的测定 MIC与MBC分别指抑制细菌生长及杀灭细菌的最低浓度。根据Fei等[17]的方法。将灭菌后冷却至50 ℃的TSA培养基加入到24孔板中，加入胎菊水提物并调整质量浓度为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 mg/mL，每孔终体积为500 μL，对照组使用0.1 mg/mL的氨苄青霉素处理。培养基凝固后，在各孔中央接种2 μL浓度为108CFU/mL的菌悬液，在37 ℃下培养24 h后观察大肠杆菌生长情况，MIC值为肉眼看不见细菌生长的最低浓度。制备100 μL菌悬液(108CFU/mL)，经过≥1.0 MIC的胎菊水提物处理1 h后再进行培养，使菌落无法长出的最低浓度即为MBC值。

1.3.5 生长曲线测定 根据Shi等[18]的方法。用LB培养基稀释菌悬液，使其OD600 nm为0.2。向25 μL菌悬液中加入胎菊水提物，使其质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、1.5 MIC和2.0 MIC，并调整终体积为250 μL，未添加胎菊水提物的菌液作为对照。在37 ℃下培养24 h，每隔2 h 取出菌液，使用酶标仪检测其吸光值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制生长曲线。

1.3.6 胞内ATP含量的测定 根据Sánchez等[19]的方法。取2 mL菌悬液(OD600 nm=0.5)，并加入胎菊水提物，使胎菊水提物终质量浓度分别为0 MIC(对照组)、1 MIC 和2 MIC。在37 ℃下处理30 min后，利用试剂盒法对其胞内的ATP进行提取，并测定其相对发光值。

1.3.7 膜电位的测定 根据Guo等[20]的报道。将125 μL 的菌悬液(OD600 nm=0.5)与0.5 μL的DiBAC4(3)荧光探针加入到黑色不透明的96孔板中，然后加入胎菊水提物，使其终质量浓度分别为1 MIC和2 MIC，对照组为未经胎菊水提物处理的菌悬液，37 ℃培养30 min后，使用多功能酶标仪测定样品在激发波长和发射波长分别为492 nm和515 nm下的荧光强度。

1.3.8 透射电镜观察 参照Li等[21]的报道。如1.3.6所述，菌悬液(OD600 nm=0.5)经过质量浓度0 MIC、1 MIC和2 MIC的胎菊水提物37 ℃处理4 h后，于8 000 g/min下离心5 min制备菌泥。4 ℃下向菌泥中加入2.5%的戊二醛固定2 h，离心并用磷酸缓冲液洗涤3次，再用1%饿酸固定2 h，重复洗涤3次。用体积分数50%，70%，90%，100%的乙醇对上述样品进行脱水处理(10 min)，利用十二烷基琥珀酸酐对其进行包埋，最后对样品进行醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色，并置于透射电镜下选取10 000× 放大倍数观察细胞形态。

1.3.9 胎菊水提物在熟猪肉中的应用 根据Guo等[22]的报道。将新鲜猪肉切成1.5 g左右的小块，于121 ℃下灭菌15 min得到无菌熟猪肉，用质量浓度为1 MIC和2 MIC 的胎菊水提物浸泡10 s后在无菌培养皿中放置30 min，未浸泡的熟肉样品作为对照组。将浓度为103CFU/mL 的大肠杆菌O157接种到熟猪肉样品中，无菌袋密闭保存在4 ℃环境下6 d，分别在第0，3，6天取出样品，对大肠杆菌进行平板计数，同时测定熟肉样品的色度(a*、b*、L*)重复3次读数取平均值。

1.3.10 数据分析 除透射电镜试验外，其他试验重复3次，试验结果以平均数±标准偏差表示，使用SPSS软件对数据进行统计分析，显著性检验采用单因素方差分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 DIZ、MIC和MBC值的测定

以抑菌圈直径(DIZ)、MIC及MBC值作为评定指标来检测胎菊水提物对大肠杆菌的抑菌效果，结果如表1所示。结果表明，胎菊水提物对7株大肠杆菌DIZ、MIC和MBC的范围分别为(12.40±0.32)～(13.80±0.41) mm，10～20 mg/mL和20～40 mg/mL。现有的研究也报道了一些植物源天然产物对大肠杆菌的抑制效果，例如乌梅有机酸和胡桃醌对大肠杆菌的MIC分别为31.25 mg/mL和60.00 μg/mL[23-24]，石榴皮多酚对大肠杆菌的MBC值为31.25 mg/mL[25]，与上述天然产物相比，胎菊水提物对大肠杆菌抑制作用处于中等偏上水平。为进一步探究胎菊水提物对大肠杆菌的抑菌机制，选取大肠杆菌O157进行后续研究。

2.2 胎菊水提物对细胞生长曲线的影响

胎菊水提物对大肠杆菌O157生长曲线的影响如图1 所示。与空白组相比，经过不同质量浓度胎菊水提物处理后的大肠杆菌的生长被明显的抑制，且抑菌效果随着胎菊水提物质量浓度的增加而增强。当胎菊水提物质量浓度大于2 MIC时，大肠杆菌被完全抑制。此外，从图1中可知，胎菊水提物对大肠杆菌的抑制主要是延长了迟缓期，缩短了对数期。

2.3 胎菊水提物对胞内ATP浓度的影响

ATP能够为所有活细胞生物体提供能量，与物质的代谢，能量的释放、储存和利用有关，是反映细胞存活状况的重要参数[20]。由图2可知，与对照组相比，胎菊水提物显著降低了菌体细胞中的ATP含量(P<0.05)，可能是由于胎菊水提物作用下受试细菌细胞膜被破坏，导致胞内ATP的泄漏，进而影响细胞能量代谢，抑制大肠杆菌生长。类似地，Fei等[17]发现橄榄多酚能够降低阪崎克罗诺杆菌胞内ATP浓度，并将其归因于细胞膜损伤，与试验研究结果一致。此外，研究[19, 26-27]表明，由于天然产物作用下ATP合成酶活性降低、K+的损失、细胞水解速率增加等均可以显著降低细菌胞内的ATP含量。

表1 胎菊水提物对7株大肠杆菌菌株的DIZ、MIC和MBC

图1 不同浓度的胎菊水提物对大肠杆菌生长的影响

2.4 胎菊水提物对细胞膜电位的影响

DiBAC4(3)是一种膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，进入细胞后可与细胞中的蛋白质结合发出荧光，因此可以通过测定细胞中的荧光强度来判断细胞膜电位的变化[18]。如图3所示，与空白对照组相比，经质量浓度为1 MIC和2 MIC的胎菊水提物处理后，菌体细胞膜的相对荧光值显著增加(P<0.05)，表明在胎菊水提物的作用下大肠杆菌细胞膜发生了去极化，且胎菊水提物质量浓度越高，去极化现象越明显。细胞膜去极化是细胞膜透性发生改变的重要表现，与胞内pH的改变及细胞膜上K+、Na+等浓度的改变有关[28]，因此上述结果表明胎菊水提物破坏了大肠杆菌细胞膜，进而改变了细胞膜电位，从而影响细菌生长。

字母不同表示存在显著性差异(P<0.05)

字母不同表示存在显著性差异(P<0.05)

2.5 透射电子显微镜结果分析

通过透射电子显微镜观察不同质量浓度胎菊水提物对大肠杆菌细胞形态的影响，结果见图4。与未受胎菊水提物处理的对照组相比，经质量浓度为1 MIC和2 MIC胎菊水提物处理(4 h)后的大肠杆菌细胞壁与细胞膜分离，内溶物发生泄漏，菌体内部出现空腔，细胞变瘪变皱，发生严重的变形和塌陷；且随着胎菊水提物质量浓度的增加破坏程度也随之加剧。由此可知，胎菊水提物能够明显破坏大肠杆菌的细胞形态，从而导致不可逆的损伤。

2.6 胎菊水提物在熟猪肉保藏中的应用

2.6.1 大肠杆菌菌落总数的变化 不同浓度胎菊水提物对接种到熟猪肉储存期间大肠杆菌的抑制作用如图5所示。结果显示，与未经胎菊水提物处理的对照组相比，在第3天和第6天，经质量浓度1 MIC和2 MIC胎菊水提物处理后的熟猪肉中大肠杆菌数显著性下降(P<0.05)。

图4 大肠杆菌细胞的透射电镜图

字母不同表示存在显著性差异(P<0.05)

此外，未经胎菊水提物处理的熟猪肉中的大肠杆菌在贮藏期内一直呈增长状态，而在胎菊水提物的作用下，在整个贮藏期内大肠杆菌的数目没有增加。这表明，胎菊水提物可抑制大肠杆菌的生长，从而延长熟猪肉的保质期。

2.6.2 色差的变化 对不同浓度胎菊水提物处理后熟猪肉的色度进行测定，结果如表2所示。与对照组相比，质量浓度为1 MIC的胎菊水提物虽然均可以降低样品的L*(亮度)值，并提高b*(黄度)值，但差异不显著(P>0.05)。当质量浓度为2 MIC时，胎菊水提物则可以显著的改变熟猪肉的L*和b*值(P<0.05)。此外，胎菊水提物对熟猪肉的a*(红度)值无显著性差异(P>0.05)。胎菊水提物呈微黄色，结合上述结果可知，1 MIC的胎菊水提物对熟猪肉的色差影响不显著，可作为熟猪肉潜在的防腐剂。

表2 不同质量浓度的胎菊水提物对熟猪肉色泽的影响†

3 结论

胎菊水提物对大肠杆菌具有良好的抑制作用，而这种抑菌作用与胎菊水提物能够延长大肠杆菌生长的迟缓期、缩短对数期、降低胞内ATP浓度、引起细胞膜去极化和破坏细胞形态造成胞内物质的泄漏有关。此外，胎菊水提物在熟猪肉6 d的贮藏期内可以降低样品中的大肠杆菌总数，且1 MIC的质量浓度对产品的色泽没有显著的影响。综上，胎菊水提物有潜力作为一种新型抑菌剂和防腐剂运用于食品工业中。在今后的研究中，还需对胎菊水提物对产品感官品质、加入剂量和安全性进行深入的探讨，从而为更好地将胎菊水提物应用于食品的贮藏提供理论依据。