干芥菜接种发酵发酵剂优化

李文青 罗凤莲,2,3 卿 泉 蒋依琳

(1. 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128； 2. 国家蔬菜加工技术研发分中心，湖南 长沙 410128； 3. 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

芥菜是中国著名蔬菜之一[1]，其营养价值、药用价值较高[2-3]。芥菜腌制发酵后有特殊鲜味和香味，但因其显著的季节性，且加工产品含盐量较高，加之发酵后的漂洗脱盐工序使产品损失了部分色、香、味[4-5]。刘大群等[6]分析了不同脱水方式腌制的萧山萝卜干的挥发性成分，采用传统风脱水方式腌制的萝卜干的挥发性香气成分种类多，且相对含量高于采用盐脱水方式腌制的萝卜干。以干芥菜为原料进行发酵可以保证原料的供应，降低产品含盐量，产品品质较高。目前，发酵芥菜的制作方式以自然发酵为主，但接种发酵能显著缩短发酵时间和提升产品品质[7-8]。敖晓琳等[9]研究表明，接种发酵能改善泡菜的口感；云琳等[10]研究发现，接种发酵泡菜的果糖、塔格糖和蔗糖含量高，其气味、滋味和总分均最高；同时，在卷心菜的发酵初期接种弯曲乳酸菌可降低发酵卷心菜中酪胺含量[11]。王一淇[12]从湖南自然发酵芥菜中筛出适合芥菜发酵的优势菌：肠系膜明串珠菌 (Leucofiostocmesenteroides，LM)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP)和戊糖片球菌(Pediococcupentosaceus，PP)。试验拟通过对这3种菌的生长曲线、产酸能力、耐盐性、耐温性及pH值适应性进行测定，选出适合干芥菜发酵的菌株，然后通过优势菌群构建和配比优化试验，对发酵干芥菜的发酵剂进行优化。旨在为发酵干芥菜产业化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干芥菜：水分含量14.4%，福建泉州；

食盐：市售；

肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CICC-21861、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ATCC-8014、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)CICC-22737：广东省微生物菌种保藏中心；

亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硼酸钠、盐酸、氢氧化钠、酚酞、甲醛、硫酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

改良MRS 培养基、MRS肉汤培养基：广东环凯微生物技术有限公司；

干芥菜培养基：将干芥菜复水洗净切碎，复水芥菜与蒸馏水以质量比1∶1的比例混匀打浆过滤，加入1%蛋白胨、2%葡萄糖，调节pH 6.8，121 ℃高压灭菌30 min，冷却，自制。

1.2 主要仪器设备

电子天平：TP-620A型，湘仪天平仪器设备有限公司；

可见分光光度计：V-5000型，上海原析仪器有限公司；

高温灭菌锅：YXQ-SG46-280S型，上海博讯医疗设备厂；

单人单面净化工作台：SW-CJ-1FD型，苏州净化设备有限公司；

全自动细菌生长测定仪：RTS-1型，上海怡赛科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 干芥菜加工工艺流程及操作要点

干芥菜复水清洗→沥干→切分→添加食盐和发酵剂→混匀装瓶→密封发酵→成品

(1) 复水清洗沥干：干芥菜和水以质量比1∶20复水30 min，清洗，沥干10 min。

(2) 接种发酵剂：以复水芥菜为基准，将制备好的发酵剂按相应的种类和比例接种至复水芥菜中。

(3) 添加食盐：以复水芥菜为基准，加入8%的食盐。

(4) 密封发酵：拌匀后装入玻璃瓶中密封，37 ℃恒温发酵。

1.3.2 菌种的活化 将安碚管用酒精棉片擦拭消毒，用酒精灯加热安碚管的凹陷封口处，封口处使用无菌吸管滴1～2滴无菌水使安碚管破裂，用无菌吸管吸取0.5 mL无菌水于管中，待干粉全部溶解，接种于5 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养24～36 h，连续转管活化2次后取几滴转接至试管斜面上保藏菌种。

1.3.3 生长曲线的测定 将斜面上的菌种用MRS肉汤培养基转管活化2代，活化后的菌株分别按体积分数5%接种至MRS肉汤培养基和芥菜培养基中(100 mL MRS肉汤培养基中加入5 mL活化后的菌种)，混匀，用全自动细菌生长测定仪测定OD850 nm值，以时间为横坐标，OD850 nm值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线图。

1.3.4 产酸能力的测定 将活化2次的菌株按体积分数5%接种至已灭菌的芥菜培养基中，混匀，取少量样品作为0 h样品，测定pH值，将各菌株于37 ℃恒温培养，每隔2 h取样、测定，以培养时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制各菌株的产酸曲线图。

1.3.5 耐盐性的测定 用食盐调节芥菜培养基的含盐量，使其食盐浓度分别为0%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，将3种菌株按体积分数5%接种至上述芥菜培养基中，混匀，37 ℃恒温培养，用全自动细菌生长测定仪测定第36 h的OD850 nm值。

1.3.6 耐温性的测定 将菌株按体积分数5%接种至芥菜培养基中，混匀，分别于17，22，27，32，37，42，47 ℃恒温培养，用全自动细菌生长测定仪测定第36 h 的OD850 nm值。

1.3.7 pH适应能力的测定 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节芥菜培养基，使其pH值分别为3，4，5，6，7，8，9，将菌株按体积分数5%接种至芥菜培养基中，混匀，37 ℃恒温培养，用全自动细菌生长测定仪测定第36 h 的OD850 nm值。

1.3.8 发酵剂的制备 按1.3.1活化菌种后，按接种量5%扩大集中培养50 mL，在菌种的对数生长期进行离心分离(4 000 r/min，20 min)，去除液体培养基，用50 mL 0.85% 的生理盐水洗涤菌悬液，制成发酵剂备用(菌浓度为108CFU/mL)。

1.3.9 优势菌群构建及其配比优化

(1) 优势菌群构建：参照洪冰[13]的方法，按表1将各菌株接种至盐度为8%的复水芥菜中，以自然发酵为对照组，37 ℃下发酵，每3 d测定各发酵产品的总酸、亚硝酸盐、氨基酸态氮和挥发酯含量，并进行感官评价。

(2) 发酵菌株的配比优化：参照王巧[14]的方法，按表2 进行发酵菌株的配比优化。按3%的接种量接种至盐度为8%的复水芥菜中，37 ℃下发酵，每3 d测定发酵产品的总酸、亚硝酸盐、氨基酸态氮和挥发酯含量，并进行感官评价。

表1 优势菌群构建

表2 发酵菌株配比优化

1.3.10 指标测定

(1) 总酸：参照文献[15]。

(2) 亚硝酸盐：按GB 5009.33—2016执行。

(3) 挥发酯含量：按GB/T 11857—2008执行。

(4) 氨基酸态氮含量：按GB 5009.235—2016执行。

(5) 感官评分：参照表3，分别从色泽(25分)、质地(25分)、香气(25分)、滋味(25分)4个方面进行感官评分，总分100分，结果取平均值。

1.3.11 数据处理及分析 采用SPSS 23软件进行显著性检验分析，P<0.05为显著性水平，采用Excel 2016软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵菌株性质

2.1.1 MRS肉汤培养基生长曲线 由图1可知，肠膜明串珠菌和戊糖片球菌的适应期大于植物乳杆菌；植物乳杆菌于培养5 h后进入对数生长期，5～13 h生长旺盛，13 h 后进入稳定生长期；肠膜明串珠菌与戊糖片球菌的生长曲线类似，于培养10 h时进入对数生长期，10～20 h生长旺盛，20 h后进入稳定生长期；3株菌株的最终OD850 nm值均为4.00左右，其中肠膜明串珠菌的OD850 nm值最高，为4.25。

表3 感官评定标准

图1 菌株的MRS肉汤培养基生长曲线

2.1.2 芥菜培养基生长曲线 由图2可知，与MRS培养基相比，3株菌株在芥菜培养基中的起酵时间延长，可能是菌株接种至新环境后需要一定时间重新合成必需的酶类、辅酶或者其他中间产物；植物乳杆菌于培养12 h后进入对数生长期，12～20 h生长旺盛，肠膜明串珠菌于培养18 h后进入对数生长期，18～28 h生长旺盛，最终OD850 nm值稳定在1.78，戊糖片球菌于培养19 h后进入对数生长期，19～27 h生长旺盛；3种菌株在芥菜培养基中最终的OD850 nm值小于MRS肉汤培养基中，可能是干芥菜复水后的营养物质与MRS肉汤培养基存在差异。

2.1.3 产酸能力 由图3可知，3株菌株的pH值随发酵时间的延长呈下降趋势，并缓慢趋于稳定。菌株的产酸能力变化规律与其生长曲线相关，发酵前期环境条件适宜，其生长代谢较快，产酸能力较强；发酵后期，培养基中的营养物质被逐渐消耗，同时培养基pH值的降低抑制了菌株的生长，使得pH值趋于平稳[16]。3株菌株的产酸能力均较强，培养36 h后pH稳定于4左右。

2.1.4 耐温能力 由图4可知，菌株的OD850 nm值随发酵温度的增加呈先增长后下降的趋势。当发酵温度为17 ℃ 时，因温度较低，乳酸菌的生长代谢活动很慢，3株菌株的吸光度都较低；随着发酵温度的升高，3株菌株的OD850 nm值不断升高；温度过高，微生物细胞的结构和代谢都受到影响，所以各菌株的OD850 nm值随之下降，当发酵温度为47 ℃时，3株菌株几乎不生长。肠膜明串珠菌的最适生长温度为32 ℃，其OD850 nm值为1.67；植物乳杆菌和戊糖片球菌的最适生长温度为37 ℃，其OD850 nm值分别为1.30，1.54。

图2 菌株的芥菜培养基生长曲线

图3 菌株的产酸曲线

同一菌株字母不同表示不同温度之间具有显著性差异(P<0.05)

2.1.5 耐盐能力 由图5可知，3株菌株的OD850 nm值随食盐浓度的增大而下降；当食盐浓度为0%时，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌的OD850 nm值最高，分别为1.60，1.25，1.50；当食盐浓度为12%时，3株菌株都停止生长，故在发酵芥菜中，食盐含量不宜超过12%。

2.1.6 pH值适应能力 由图6可知，3株菌株的OD850 nm值随pH值的升高呈先升高后下降的趋势，pH值过高或过低都会抑制菌株的生长；肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的最适生长pH值为6，其OD850 nm值分别为1.67，1.27；戊糖片球菌的最适生长pH值为7，其OD850 nm值为1.49。

2.2 优势菌群的建立

2.2.1 对总酸含量的影响 由图7可知，发酵干芥菜的总酸含量随发酵时间的增加而上升，并于发酵后期逐渐平稳。乳酸菌利用原料发酵产酸，总酸含量逐渐上升，发酵后期，发酵液pH值较低，乳酸菌群的活动受到抑制。总酸含量在发酵第3～9天上升较快；从第6天开始，3种菌混合发酵的样品总酸含量高于其他组，发酵18 d后，3种菌混发酵的样品总酸含量达(0.97±0.016)%，显著高于其他样品(P<0.05)；3种菌混合发酵时产酸较快，发酵产品总酸含量最高。

同一菌株字母不同表示不同含盐量之间具有显著性差异(P<0.05)

同一菌株字母不同表示不同pH值之间具有显著性差异(P<0.05)

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

2.2.3 对氨基酸态氮含量的影响 由图9可知，发酵干芥菜的氨基酸态氮含量随发酵时间的增加呈先上升后略有下降的趋势，可能是原料中的蛋白质通过相关酶和微生物的作用被分解为氨基酸，使得初期氨基酸态氮含量不断增加，发酵后期，发酵液中的盐分提高了细胞液的渗透压，芥菜细胞被破坏，一些游离氨基酸随细胞渗透到泡菜液中被微生物利用，产品中氨基酸态氮含量减少[19-20]。发酵第3～9天氨基酸态氮含量上升速度较快，发酵9 d后，3种菌混合发酵产品的氨基酸态氮含量显著高于其他组(P<0.05)，其含量为0.103%～0.112%，其他接种发酵的干芥菜之间无显著性差异(P>0.05)。说明接种不同的菌种对发酵干芥菜的氨基酸态氮含量有较大影响，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌同时使用时，氨基酸态氮含量较高，发酵产品品质较好。

2.2.4 对挥发酯含量的影响 由图10可知，发酵干芥菜的挥发酯含量随发酵时间的增加呈先上升后平稳的趋势，发酵第12天，发酵干芥菜的挥发酯含量达到顶峰，除只接种戊糖片球菌的试验组外，其他接种发酵的产品挥发酯含量显著高于自然发酵组(P<0.05)；发酵12 d后，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌3种菌混合发酵组与植物乳杆菌、戊糖片球菌两种菌混合发酵组的挥发酯含量显著高于其他组(P<0.05)，且3种菌混合发酵的挥发酯含量最高，为1.79～1.99 g/kg。综上，不同菌种对发酵干芥菜挥发酯含量有较大影响，其中3种菌混合发酵产品的挥发酯含量较高，风味较好。

2.2.5 对感官评分的影响 由表4可知，自然发酵产品组织较松散，酸味较淡，感官评分最低，为(68.5±0.7)，接种发酵产品在质地、香气和滋味3方面都显著优于自然发酵产品(P<0.05)；3种菌混合发酵产品的发酵香气浓郁，发酵液较透明，口味酸爽脆嫩，其感官评分显著高于其他发酵组(P<0.05)。因此，后续对3种菌株混合进行进一步配比，以得到最佳的配比。

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

2.3 混合菌株配比优化

2.3.1 对总酸含量的影响 由图11可知，发酵12 d后，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶2∶1时总酸含量最高(为1.00%～1.11%)，其次为2∶3∶2(总酸含量为1.01%～1.07%)；发酵第18天，3种菌株配比为2∶3∶2时的总酸含量最高，与其他组有显著性差异(P<0.05)。综上，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶2∶1和2∶3∶2时的发酵产品总酸含量较高，产品品质较好。

2.3.2 对亚硝酸盐含量的影响 由图12可知，各组亚硝酸盐含量均较低，分别于第6天或第9天出现峰值，最高为1.17 mg/kg；肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶3∶2时的亚硝酸盐含量显著低于其他组(P<0.05)，于发酵第18天稳定于0.34 mg/kg；其次为2∶2∶1和3∶1∶2的，分别于发酵第18天稳定于0.41，0.43 mg/kg，但两者之间无显著性差异(P>0.05)。综上，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶3∶2，2∶2∶1，3∶1∶2时的发酵产品亚硝酸盐含量较低。

表4 发酵干芥菜的感官评分†

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

2.3.3 对氨基酸态氮含量的影响 由图13可知，发酵12 d 后，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶3∶2时的氨基酸态氮含量最高(为0.13%～0.16%)，其次为2∶1∶3的(0.13%～0.14%)，发酵18 d后，其氨基酸态氮含量显著高于其他组(P<0.05)。综上，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶3∶2，2∶1∶3时的发酵产品氨基酸态氮含量较高，产品鲜味较好。

2.3.4 对挥发酯含量的影响 由图14可知，发酵12 d后，各组挥发酯含量均趋于稳定，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为3∶2∶3，2∶3∶2，2∶2∶1的挥发酯含量显著高于其他组(P<0.05)；其中混合菌株配比为3∶2∶3时的挥发酯含量最高(为2.22～2.51 g/kg)，其次为2∶3∶2和2∶2∶1的。说明肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为3∶2∶3，2∶3∶2，2∶2∶1时的发酵产品挥发酯含量较高，产品有发酵芥菜特有的风味。

2.3.5 对感官评分的影响 由表5可知，第6组产品的感官评分最高，其次是第8组，通过显著性分析可知，这两组产品之间的感官评分差异显著(P<0.05)；各组产品在色泽评分上差异不显著(P>0.05)，第6组和第8组在质地评分和香气评分上显著优于其他组(P<0.05)，第6组在滋味评分上优于其他组(P<0.05)。综上，肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌配比为2∶3∶2，3∶2∶3时的发酵产品感官评分较高，酸度适中，发酵香气较浓，风味较好。

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

同一发酵天数字母不同表示不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)

表5 混菌配比对发酵干芥菜感官评分的影响†

3 结论

以干芥菜作为原料，从肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌3株乳酸菌种中筛选发酵剂，分析了3种菌的发酵特性。结果表明：3株菌均可作为干芥菜的发酵菌株，3种菌株混合接种发酵的干芥菜产品总酸、氨基酸态氮、挥发酯含量和感官评分最高，亚硝酸盐含量最低。其中肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌∶戊糖片球菌=2∶3∶2时，发酵干芥菜的总酸含量为1.07%，氨基酸态氮含量为0.16%，挥发酯含量为2.48 g/kg，感官评分为91.0，其品质较高。研究探讨了以干芥菜为原料生产发酵芥菜的可能性，通过人工接种乳酸菌提升产品品质，缩短发酵周期。但使用的芥菜原料和菌种种类有限，下一步将研究不同原料品种和不同菌种对产品品质的影响、发酵成品杀菌方式的优化等。