化痰活血降气方对慢性阻塞性肺疾病大鼠脏器指数及血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平的影响∗

余 宁 周新燕 张 念 余 丹 杨 硕 叶树鸣

（湖北省武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种因长期吸入有害气体或颗粒导致进展性的气流受限不完全可逆的呼吸系统疾病[1]。本实验团队前期临床研究表明，化痰活血降气方能显著降低COPD患者多种炎症因子水平和C反应蛋白（CRP）的水平，减轻炎症反应，从而减少气道重塑和气道阻塞，缓解COPD喘气、胸闷、呼吸困难等急性症状[2-3]。本实验通过化痰活血降气方对COPD大鼠模型进行干预，对大鼠肺组织进行病理形态学观察，检测肺脏、脾脏、胸腺等脏器指数和血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、内皮素-1（ET-1）水平，进一步探讨化痰活血降气方在COPD治疗中的抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级wistar大鼠36只，来源于北京斯贝福生物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0002]。大鼠体质量200～220 g，实验动物合格证号：NO.11401500057734。在室内采光、通风良好，温度20～25℃，相对湿度30%～50%的环境下饲养，自由饮水、摄食。

1.2 实验药物

醋酸泼尼松片（华中药业股份有限公司，生产批号20180505，每片5mg）。化痰活血降气方颗粒剂（四川绿色药业生产），组成：赤芍（批号18040038）10 g，桃仁（批号18060087）10 g，紫苏子（批号18080061）10 g，款冬花（批号18020095）10 g，丹参（批号 18080028）30 g，瓜蒌皮（批号18050010）10 g，浙贝母（批号18040054）10 g，麻黄（批号17050111）10 g，黄芩（批号18030117）10 g，鱼腥草（批号17100130）30 g，杏仁（批号 18060087）10 g，苦参（批号18020100）10 g。

1.3 仪器与试剂

1）仪器：FlexStation 3多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），JT-12J电脑生物组织脱水机（武汉俊杰），JK-6生物组织摊烤片机SCXK（京）2016-0002），德国Leica RM 2016轮转式病理切片机（德国Leica公司），奥林巴斯BX53型生物显微镜（日本奥林巴斯）。2）试剂：大鼠TNF-α、IL-1β、ET-1酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；无水乙醇（10009218，国药集团），二甲苯（10023418，国药集团），盐酸（10011018，国药集团），包埋石蜡（69019361，国药集团），中性树胶（10004160，国药集团），苏木素（Sigma，H9627）。

1.4 分组及模型制备

1）分组：将36只大鼠随机分为6组：为空白组、阳性对照组、模型组和化痰活血降气方大、中、小剂量组，每组6只。2）模型制备：采用气管内滴注LPS加烟熏法复制COPD模型。分别在第1、14天气管内滴注LPS（0.1 mg/100 g），第2至第13日，第15至28日时在容积为48 L的玻璃密闭箱内持续熏黄鹤楼牌香烟雾30 min，每日1支，每日1次。造模28 d结束后统一药物干预。

1.5 干预方法

造模结束后，化痰活血降气方组和阳性对照组分别进行中药颗粒及阳性药物灌胃治疗，持续28 d。临床用药量为160 g/d，换算成动物灌胃剂量为160×0.018×5=14.4 g/（kg·d）。中剂量组按照14.4g/（kg·d）灌胃，大剂量组为中剂量组×2，即28.8 g/（kg·d），低剂量组为中剂量组/2，即7.2 g/（kg·d）。阳性对照药物用醋酸泼尼松片灌胃28 d，每天1次，临床剂量为50 mg/d，灌胃剂量为50×0.018×5=4.5 mg/（kg·d）。化痰活血降气方组在造模结束后分别予相应用药剂量中药溶液5mL/d灌胃，阳性对照组予泼尼松混悬液5 mL/d灌胃，模型组予生理盐水5 mL/d灌胃。

1.6 观察指标

1.6.1 苏木青-伊红（HE）染色观察对大鼠肺组织病理学形态变化 对大鼠左肺取肺组织脱水，经透明，浸蜡，包埋，切片烤片，脱蜡，经Mayer氏苏木素染液染色5～7 min后浸洗返蓝，1%的盐酸酒精分化2～5 s后浸洗返蓝，1%的伊红染液染1 min水洗，风干后中性树胶封片，最后镜检。取100和200倍各3张。

1.6.2 检测各组大鼠肺脏、脾脏和胸腺指数 摘取肺脏、脾脏和胸腺后，用滤纸吸干残血后，称质量（mg），分别除以大鼠体质量（g），再乘以10，得到肺脏指数、胸腺指数和脾脏指数。肺脏指数=肺脏质量（mg）/大鼠体质量（g）×10，胸腺指数=胸腺质量（mg）/大鼠体质量（g）×10，脾脏指数=脾脏质量（mg）/大鼠体质量（g）×10。

1.6.3 ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平 收集大鼠血液，在3 000 r/min离心10 min，吸取上部清亮的血清加样，37℃孵育90 min。弃去孔内液体，洗板5次，立即每个孔中加入生物素化抗体100 μL，37℃孵育1 h，洗板5次，每孔加酶结合物抗体工作液100 μL，37℃温育30 min。弃去孔内液体，洗板5次，每孔加底物100 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加100 μL终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值），计算各样本中相关指标浓度。

1.7 统计学处理

应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（）表示。选用正态性检验及方差分析，若服从正态分布及方差齐性检验，采用单因素方差分析及事后检验多重比较（LSD），方差不齐采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学结果

见图1。空白组肺泡结构完整，肺泡壁未见明显异常。模型组大量炎症细胞浸润，肺泡壁变薄，肺泡间隔断裂融合，肺泡腔变大。阳性对照组炎症细胞显著减少，肺泡壁明显增厚，肺泡腔变小。化痰活血降气方大剂量组炎症细胞浸润明显好转，肺泡壁明显增厚，肺泡间隔断裂融合较模型组改善，肺泡腔显著变小。化痰活血降气方中剂量组炎症浸润稍有好转，肺泡壁稍有增厚，肺泡腔稍变小。化痰活血降气方小剂量组肺部炎症细胞浸润，肺泡壁薄，肺泡腔融合现象与模型组较为接近。

图1 各组大鼠肺组织病理学比较（HE染色，200倍）

2.2 各组脏器指数变化比较

见表1。1）肺脏指数：与空白组比较，模型组肺脏指数显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组和化痰活血降气方大剂量组肺脏指数显著降低（P＜0.01），中、小剂量组肺脏指数差异无统计学意义（P＞0.05）。与阳性对照组比较，大剂量组肺脏指数差异无统计学意义（P＞0.05）。2）胸腺指数：与空白组比较，模型组胸腺指数稍有降低，但无明显差异（P＞0.05）。与模型组比较，化痰活血降气方各剂量组和阳性对照组差异均无统计学意义（P＞0.05）。3）脾脏指数：与空白组比较，模型组脾脏指数显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组显著增高（P＜0.05），化痰活血降气方各剂量组均无明显差异（P＞0.05）。

2.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平比较

见表2。与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和化痰活血降气方各剂量均能显著降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、ET-1水平（P＜0.05或P＜0.01），其中大剂量组血清TNF-α、IL-1β水平低于中、小剂量组（P＜0.05或P＜0.01），大剂量组血清ET-1水平低于小剂量组（P＜0.01）。与阳性对照组比较，大剂量组血清TNF-α、ET-1水平无统计学差异（P＞0.05）。

表1 各组脏器指数比较（±s）

表1 各组脏器指数比较（±s）

与空白组比较，△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同

组别空白组模型组阳性对照组化痰活血降气方大剂量组化痰活血降气方中剂量组化痰活血降气方小剂量组n 6 6 6 6 6 6肺脏指数42.35±3.09 52.97±3.45△45.21±3.13▲▲46.11±1.55▲▲50.39±2.23 51.47±2.37胸腺指数13.39±2.06 9.60±0.93 12.25±2.27 10.89±1.65 9.12±3.14 9.64±2.38脾脏指数21.11±2.06 15.36±2.43△19.97±3.52▲▲17.93±0.71 16.63±1.25 16.68±0.96

表2 各组血清细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组血清细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

与阳性对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，与化痰活血降气方大剂量组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组阳性对照组化痰活血降气方大剂量组化痰活血降气方中剂量组化痰活血降气方小剂量组n 6 6 6 6 6 6 TNF-α 79.94±2.73 255.7±16.70△118.39±7.84▲▲121.05±5.41▲▲169.59±8.37▲▲**##186.9±10.10▲▲**##IL-1β 36.97±2.29 124.1±6.34△58.19±4.36▲▲74.68±6.04▲▲*92.14±6.63▲▲**#102.2±5.72▲▲**##ET-1 35.48±2.28 75.53±3.01△45.16±3.74▲▲52.68±2.09▲▲60.72±2.32▲▲**65.98±4.85▲**##

3 讨 论

COPD属于中医学“喘”“肺胀”等范畴，中医学认为“痰”“瘀”是本病的主要病理因素，病机特点是本虚标实。痰瘀为标，肺脾肾气虚为实[4]。外邪袭肺，肺失宣降，水液输布失常，积聚成痰湿；痰湿困脾，脾气虚致运化功能下降；脾湿内蕴，日久郁而化热，灼伤肺络；痰湿内蕴，阻滞气机，气不行则血瘀。化痰活血降气方中丹参、赤芍性微寒，清热活血祛瘀加以桃仁活血化瘀，润肠通便；黄芩善清上焦邪热、配以苦参清热燥湿；瓜蒌皮清热化痰、宽胸散结；鱼腥草配以浙贝母、黄芩清热化痰、止咳平喘；麻黄宣肺平喘，紫苏子、款冬花、杏仁降气化痰平喘。全方共奏清热化痰、活血化瘀平喘之效。

本研究通过气管内滴注LPS加烟熏法复制模型，观察病理形态改变，COPD模型组大鼠肺组织有大量炎症细胞浸润，肺泡壁变薄，伴有肺泡断裂融合肺泡腔变大，符合COPD的病理改变证明造模成功。与模型组比较，化痰活血降气方大剂量组炎症细胞的浸润明显好转，肺泡间隔的断裂融合改善，中剂量组肺组织炎性改变也有所减轻，并且大剂量组减轻炎症反应的作用与醋酸泼尼松相当，佐证了化痰活血降气方可以减轻气道炎症反应和减轻肺组织重构。

脏器指数在一定程度上可以衡量机体的变化，其中肺脏指数是反映机体肺部炎症的指标[5]，也反映大鼠肺的损伤程度[6]，胸腺、脾脏指数则反映机体免疫功能[5，7]。本实验研究结果显示，模型组肺脏指数较空白组显著增高，提示COPD大鼠有肺部炎症反应和肺损伤，与模型组比较，阳性对照组及化痰活血降气方大剂量组肺脏指数显著降低，提示化痰活血降气方大剂量可以显著减轻肺组织的炎症反应，效果与醋酸泼尼松相当。化痰活血降气方各剂量组脾脏及胸腺指数与模型组无显著差异，提示化痰活血降气法对相关免疫功能均无显著提高作用，与组成化痰活血降气方的中药药物作用相一致。

COPD是呼吸系统常见的慢性炎症性疾病，TNF-α是巨噬细胞及活性T细胞分泌的，既是急性炎症的相关指标，也是炎症反应的起始因子，通过促进炎症细胞聚集活化和加速中性粒细胞外蛋白分解，参与炎症反应，加重了COPD气道炎症反应和气道重塑[8-10]。IL-1β炎症因子由脂多糖内毒素激活中性粒细胞释放，从而引起肺组织水肿，加重气道炎症反应[11-12]；COPD患者的肺血管内皮细胞大量合成及释放ET-1[13-14]，ET-1通过收缩肺血管引起缺血缺氧，使COPD患者出现喘息、呼吸困难等症状；同时还参与IL-6、IL-8炎症因子的释放，引起气道炎症反应[15-16]。本实验研究结果显示模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ET-1炎症因子较空白组均显著上升，提示COPD不仅会导致肺组织的炎症反应，也会使血清中炎症因子水平显著上升。经药物治疗后都有不同程度的下降，其中以大剂量组的疗效最优，与醋酸泼尼松抗炎作用相当，所以化痰活血降气方可通过降低血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、ET-1的水平，减轻气道炎症反应，并且ET-1分泌减少可以缓解肺血管收缩引起的肺部缺血缺氧，IL-β1分泌减少能够减轻肺组织水肿，均能缓解COPD喘息、呼吸困难的症状。

综上所述，化痰活血降气方可以通过降低血清中TNF-α、IL-1β、ET-1水平，减轻气道炎症反应，缓解肺血管收缩引起的缺血缺氧和肺组织水肿，降低肺脏指数，减轻COPD喘息、呼吸困难的症状，证实了化痰活血降气方能通过减轻COPD的炎症反应，阻止病情加重。