金匮肾气丸对甘油性急性肾衰竭大鼠肾功能的改善作用∗

卢耿信 陈锐洲 肖珊珊 黄锐韵 林 俊 梁章炜 张尹州 指导 许小洋 王桂房

（广州医科大学，广东 广州 511436）

急性肾功能衰竭（ARF）是指由各种原因引起的肾功能在短期内急剧下降，导致体内代谢产物潴留，水/电解质和酸碱平衡紊乱的临床综合征[1]。外伤性和非外伤性横纹肌溶解所致的ARF约占临床所有ARF病例的15%～20%，且横纹肌溶解性ARF透析治疗效果欠佳，死亡率高[2]。目前，临床上多采用连续肾脏替代疗法（CRRT）来治疗ARF患者[3]。但CRRT属有创治疗，易并发感染，且血液净化技术费用昂贵，一些偏远地区及基层医院缺乏一定的设备条件，不能得到实际应用。因此，从ARF的机制出发，通过某些药物减轻肾单位的病变，加快肾单位的复原，促进肾脏功能的恢复具有重要意义。

金匮肾气丸是汉代张仲景《金匮要略》中之处方，是温补肾阳的经典方剂，用于肾阳虚之水肿，腰膝酸软，小便不利，畏寒肢冷[4]。现代研究显示，金匮肾气丸中主要成分如地黄、牡丹皮、车前子等具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多种生物学效应[5-6]。在ARF的发病机制中，由各种伤害性刺激导致的肾小管上皮细胞的缺血、缺氧和肾小管阻塞，进而促使氧自由基增多、炎性因子释放和细胞凋亡激活等是关键的发病环节[7]。鉴于金匮肾气丸主要成分的上述功效，我们推测其可能在ARF的治疗中发挥作用。因此，本实验拟在甘油法复制ARF大鼠模型的基础上，探究金匮肾气丸对其干预效应，以期为ARF的防治提供实验依据，并为后续的深入研究奠定前期的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄雄性SD大鼠，体质量200 g左右。大鼠饲养于温度（26±4）℃，湿度（55±5）%动物实验室，动物使用许可证号：SYXK（粤）2016-0168。动物质量合格证明号：No.44007200064708。动物饲养在广州医科大学动物实验中心设施内进行。

1.2 药物 金匮肾气丸（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，国药准字Z11020147），其主要成分为：地黄、山药、酒萸肉、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂枝、附子（炙）、牛膝（去头）、盐车前子。辅料为蜂蜜。

1.3 试剂与仪器 肌酐测定试剂盒（苦味酸法，中生北控生物科技股份有限公司，YZB/京1735-2013）；磺基水杨酸（磺柳酸）；甘油；离心机（TDZ4-WS长沙平凡仪器仪表有限公司）；722型可见分光光度计（Leng-Guang Tech）等。

1.4 分组与造模 将SD雄性大鼠采用随机数字表法分成空白对照组（对照组）、急性肾功能衰竭模型组（肾衰组）和急性肾功能衰竭治疗组（治疗组），每组各8只，各组大鼠实验前禁水24 h，肾衰组和治疗组以50%甘油按10 mL/kg分别在大鼠后肢肌肉注射，一般在2 h后出现血红蛋白尿，48 h形成稳定模型[8]。

1.5 给药方法 于造模当天开始给药，给药期间每组予以普通饲料及水饮食，治疗组连续给金匮肾气丸4 d，给药方式为灌胃。灌胃前，先将金匮肾气丸磨为粉末，称重，参照文献[9]并结合预实验的结果，确定本实验的给药剂量为4.0 g/kg，用5 mL温生理盐水溶解后灌胃。灌胃采用16号灌胃针头从大鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻向内推进，进入食管后，有落空感，大约进入5～6 cm，开始灌药，每日1次。对照组和肾衰组每日予以同剂量生理盐水灌胃1次。

1.6 检测指标 1）肌酐测定。各组大鼠均于给药4 d后以10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血后，静置离心，离心机3 000 r/min转速离心6 min，分离血清，按肌酐测定试剂盒的说明测血肌酐浓度。2）尿蛋白测定。4 d后磺基水杨酸法测尿蛋白，尿蛋白测定取少量尿液滴于玻片上，加4%磺基水杨酸2滴，观察混浊与否及程度判断尿蛋白的含量。“-”：减号为阴性，记-1分，说明无蛋白。加入试剂后，尿液仍清晰，在黑色背景时，仍看不到浊表现。“±”：加减号，记0分，代表尿里有微量蛋白。加入试剂后出现白色轻度混浊，仅在黑色背景时可以看到。“+”：一个加号，记1分，代表尿里有中等量蛋白。加入试剂后，出现白色轻度混浊，无絮状颗粒出现。“++”：2个加号，记2分，代表尿里有较多量蛋白。加入试剂后，出现明显白色混浊并出现颗粒状沉淀。“+++”：3个加号，记3分，代表尿里有多量蛋白。加入试剂后，出现絮状白色沉淀。“++++”：4个加号，记4分，代表尿里有大量蛋白。加入试剂后，出现较大凝块的白色沉淀。3）蛋白管型镜检。尿液离心（3 000 r/min），去上清，留沉淀约0.2 mL，轻摇离心管，充分摇匀，吸一滴于载玻片，制片，镜下观察（放大倍数10×40）。每份尿液样本均滴于4张载玻片上，在镜下取中间视野计算尿管型数，以4张载玻片总的尿管型数除以4作为该样本尿管型的平均数，最后再计算每组均值并进行组间比较。4）观察肾脏皮髓质纹理，计算肾/体质量比。纵向剖开肾脏，观察皮髓质条纹、色泽，淤血情况，两肾称重，计算肾/体质量比，肾/体质量比=双肾重/体质量。

1.7 统计学处理 应用SigmaPlot12.5 for Windows统计软件。计量资料以（）表示。生存天数比较采用χ2检验，组间计量数据的显著性比较选用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生存曲线比较 见图1。在实验期间死于肾衰竭的大鼠例数被视为完全病例，在实验期间死于与肾衰竭无关的原因或到实验结束时仍存活的大鼠病例被视为删失病例，采用Kaplan-Meier生存函数法并进行Log Rank单因素生存分析，24只大鼠平均分为3组，造模当天开始连续灌胃4 d后，对照组存活8只，肾衰组存活4只，治疗组存活6只，实验期间，对照组、肾衰组和治疗组的平均生存期分别为（5.000±0.000）、（4.250±0.293）和（4.625±0.246）d，肾衰组的生存天数明显比对照组短（χ2=4.998，P＜0.05），提示急性肾衰竭造模成功。治疗组与肾衰组比较，生存天数有所增加但无统计学差异（χ2=0.979，P＞0.05），可能与例数不足有关。

图1 各组大鼠存活时间

2.2 各组大鼠血肌酐检测水平比较 见图2。各组SD大鼠中，对照组、肾衰组和治疗组的血肌酐浓度分别为（48.13±11.76）、（169.75±41.58）和（116.67±26.14）μmol/L，肾衰组血肌酐浓度明显比对照组高（t=7.62，P＜0.05），说明甘油导致的挤压综合征对SD大鼠肾脏造成肾衰竭，提示造模成功。治疗组与肾衰组比较，血肌酐水平显著降低（t=3.255，P＜0.05），提示金匮肾气丸对肾脏功能具有保护作用。

图2 金匮肾气丸对肾衰大鼠血肌酐的影响

2.3 各组磺基水杨酸法尿蛋白检查结果比较 见图3。尿蛋白检测结果为：对照组均为“-”；肾衰组3只为“+++”，1只为“++++”；治疗组5只为“+”，1只为“++”。经转换为分值后的数据分别为：对照组（-1.000±0.000），肾衰组（3.25±0.500），治疗组（1.330±0.408）。治疗组尿蛋白的程度明显比肾衰组低（t=9.156，P＜0.05），提示金匮肾气丸具有修复滤过膜、减少蛋白质滤过、保护肾单位的作用。

图3 金匮肾气丸对肾衰大鼠尿蛋白的影响

2.4 各组尿液镜检结果 见图4。各组SD大鼠中，肾衰组尿液镜检发现有明显蛋白管型（t=14.776，P＜0.05），说明挤压综合征对SD大鼠肾脏造成损伤。治疗组尿液镜检也发现有明显蛋白管型（t=5.164，P＜0.05），治疗组与肾衰组比较，蛋白管型显著减少（t=9.698，P＜0.05），提示金匮肾气丸具有减少挤压综合征所致管型尿的作用。

图4 各组大鼠镜检查结果比较（400倍）

2.5 各组肾脏纵向剖开图和肾系数比较 见图5。各组SD大鼠中，肾衰组与治疗组的肾脏形态与对照组比较均有一定程度的病变。对照组肾形态大小正常；肾衰组肾脏明显变大，质量变重，皮质缺血，髓质淤血；治疗组肾脏与肾衰组相比有所减小，皮质正常，髓质淤血与肾衰组比较无明显差异（图5）。肾衰组与对照组相比，肾/体质量比明显增大（t=4.236，P＜0.05）治疗组与对照组相比，肾/体质量比也明显增大（t=3.397，P＜0.05），治疗组比肾衰组肾/体质量比略有减小，但无统计学差异（t=1.177，P＞0.05）（表1）。提示金匮肾气丸在此时间段内尚不具备完全逆转肾脏病理改变的作用。

图5 各组大鼠肾脏纵向剖开图比较

3 讨 论

急性肾功能衰竭是多种病因引起的急性肾损害，使肾小球过滤下降，机体电解质、酸碱失衡，出现代谢酸中毒、高血钾的症状[12]。急性肾衰竭可由全身性严重感染（如脓毒血症）[13]以及肾脏本身的功能障碍导致，如肾血管收缩、肾小球病变、肾小管阻塞、肾小管原尿回漏入间质等[1]。甘油法致大鼠急性肾衰竭模型中，甘油法导致的挤压综合征引起横纹肌溶解，从肌细胞中释放出肌红蛋白，经肾小球滤过后，在肾小管沉淀堵塞，并损伤肾小管。另外，肾小球及肾小管周围纤维蛋白沉积，血管内血淤积，血栓形成，血流不畅，导致肾小球滤过率下降，肾小管坏死[8]。

表1 各组大鼠肾/体质量比较（±s）

表1 各组大鼠肾/体质量比较（±s）

与对照组比较，∗P＜0.05；正常雄性大鼠肾/体质量比为0.73～0.97

组别对照组肾衰组治疗组n846肾质量（g）1.77±0.30 2.71±0.60*2.51±0.56*体质量（g）205.13±17.78 198.13±16.39 204.50±17.20肾/体质量比0.86±0.10 1.36±0.28*1.22±0.22*

本实验通过对急性肾衰竭大鼠使用金匮肾气丸，探究其对肾衰竭肾功能的改善情况。研究显示急性肾功能衰竭伴有严重的生化指标紊乱，表现为血肌酐等代谢废物水平的升高，同时伴有尿蛋白、蛋白管型等病理表现。血肌酐是肌酸代谢产物，由肾脏排出，其水平的升高反映肾脏的滤过功能下降[10]。本实验结果发现，利用甘油肌肉注射可导致大鼠产生明显的急性肾功能损伤，肾衰组大鼠4 d后死亡4只，金匮肾气丸灌服可显著降低死亡数量（死亡2只）。结果说明金匮肾气丸对甘油所致急性肾衰竭的肾功能有改善作用。

治疗组与肾衰组比较，血肌酐水平显著降低，提示金匮肾气丸对肾脏功能具有保护作用，这可能与金匮肾气丸中地黄、丹皮酚、车前子等成分有关。现代药理研究表明，地黄有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种生物学效应[6]；丹皮酚有抗氧化、抗炎抗菌等方面的药理活性[7]；车前子有利尿、消炎、抗氧化方面的药理活性[14]。这些药物可能对损伤肾单位有保护与修复作用，使血肌酐等代谢废物得以排出。尿蛋白检测结果显示，治疗组的尿蛋白水平明显比肾衰组低，说明金匮肾气丸具有保护肾单位、减少蛋白质滤出的作用。其机制可能与药物抑制JAK2/STAT3信号通路的活化、抑制炎症因子过度释放，从而下调损伤的肾单位的炎症水平有关[15-17]；也有可能与本方在急性肾衰竭大鼠中，促进巨噬细胞、淋巴细胞、核因子-κB、血红素加氧酶-1和硝基酪氨酸的表达增加有关[18]。治疗组与肾衰组比较，蛋白管型虽仍存在但数目显著减少，提示金匮肾气丸具有减少挤压综合征所致管型尿的作用，但在实验期间未见其有消除蛋白管型作用，其机制可能与上述药物对部分肾小管的修复和保护功能有关。治疗组与肾衰组比较，肾系数略有减少，但无统计学差异，提示金匮肾气丸在较短的时间内尚不能逆转肾脏的病理变化。

由于本研究为医学本科生的课外探索性实验，受各种条件的限制，实验尚缺分子机制的探讨，这部分内容有待进一步深入，但本研究为后续对金匮肾气丸改善急性肾衰竭机制的探讨提供了前期的实验基础。

综上所述，金匮肾气丸对急性肾衰竭肾功能具有一定的改善作用，至于金匮肾气丸对抗急性肾衰竭的分子机制还有待进一步的探讨。