胃肠手术患者瑞芬太尼相关基因位点检测在术中麻醉药物剂量评估中的应用

胡玉皎，张 莹，周铁成，王 昊，成丹丹，郝晓柯，刘家云

（空军军医大学西京医院a.全军临床检验中心；b.麻醉科,西安710032）

瑞芬太尼（remifentanil，REM）可用于全身麻醉（general anesthesia，GA）诱导和术中维持镇痛，麻醉起效快，作用持续时间短，对患者各项血液动力学指标影响较小，是目前最常使用的麻醉药物[1]。麻醉药物经呼吸道吸入、静脉或肌肉注射进入体内后产生中枢神经系统抑制，其不良反应和副作用与中枢神经系统抑制程度和血液内药物浓度有关[2]。本研究通过采用荧光探针原位杂交法（fluorescence in situ hybridization，FISH），使用数字化荧光检测仪对消化外科胃肠手术患者瑞芬太尼麻醉药物相关基因耐药位点OPRM1(118A＞G)，CYP3A4*1G(25343C＞T)，ABCB1(3435T＞C)，CYP3A4*18B(A＞G)进行检测，旨在根据患者不同基因型，分析其药物作用和代谢特性，指导患者合理用药，达到提高药效、降低毒性和减少不良反应发生的效果，为手术患者麻醉药物的使用提供精准的个体化用药指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月～2019年12月在本院消化外科接受麻醉药物瑞芬太尼耐药位点OPRM1(118A＞G)，CYP3A4*1G (25343C＞T)，ABCB1(3435T＞C)，CYP3A4*18B(A＞G)检测的胃肠手术患者5 249例，所有受检患者均顺利完成手术麻醉，其中食管手术759例，平均年龄59.02±11.86岁，男性478例，女性281；胃部手术2 613例，平均年龄58.17±12.48岁，男性1 983例，女性630例；肠道手术1 877例，平均年龄57.97±12.25岁，男性1 094例，女性783例。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器：TL998A荧光检测仪（西安天隆公司）；Flutec 48E微量荧光检测仪（西安天隆公司）。

1.2.2 试剂：10×NH4Cl预处理液，用注射灭菌水按9∶1比例稀释为1×NH4Cl工作液，用于样本前处理时裂解红细胞；软件设定液：用于反应标准曲线的制备；核酸纯化试剂（耀金保），用于检测分析前保存样本；测序反应通用试剂盒（耀金分），用于荧光原为杂交、数字化荧光检测基因型分析。以上试剂均购自北京华夏时代基因公司。

1.3 方法

1.3.1 采集血样：于EDTA抗凝管中，采集患者静脉血2ml，室温放置，24 h内完成检测。

1.3.2 富集白细胞样本：取200μl全血标本加入1.5ml离心管中；加入1.0ml 10×NH4Cl预处理液，漩涡混匀，室温静置5min，待红细胞完全裂解、液体颜色变为透亮红色后3 000r/min离心5 min，弃去上层液体，重复该步骤一次。加入30μl核酸纯化试剂，漩涡混匀，室温静置60 min。

1.3.3 样本检测：完成前处理的样本分别加入含有OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1和CYP3A4*18B探针的测序反应试剂，用TL998A荧光检测仪、Flutec 48E微量荧光检测仪进行检测并判读结果。

1.3.4 质量控制：每次实验加阳性对照(阳性质控品)及阴性对照(核酸纯化试剂)，用来监测检测系统和试剂是否有效，以及样本处理过程中是否存在污染。

1.4 统计学分析 收集、记录各组数据，使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数变量资料用均值±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，不同基因型之间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组基因型分布 见表1。食管、胃部、肠道手术患者组OPRM1基因型分布（χ2=1.83，P＞0.05），CYP3A4*1G基因型分布（χ2=2.17，P＞0.05），ABCB1基因型分布（χ2=8.01，P＞0.05），差异不具有统计学意义。三个患者组CYP3A4*18B基因分布差异有统计学意义 (χ2=100.29，P＜0.01)，故食管、胃部、肠道手术患者组CYP3A4*18B基因分布不同。

表1 食管、胃部、肠道手术患者OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布频率[n(%)]

2.2 基因型分布频率及术中瑞芬太尼用量 见表2。OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布频率与术中瑞芬太尼用量的关系，OPRM1(118A＞G)GG基因型患者与AG，AA基因型相比，需要较高剂量缓解疼痛[3]；CYP3A4*1G(25343C＞T)TT基因型患者药物酶代谢活性低，应降低药物使用剂量、减慢静脉泵注速度才可避免副作用的发生[4]；ABCB1(3435T＞C) TT基因型较CT/CC患者对瑞芬太尼应答较好，可低剂量慢速给药[5]。

表2 OPRM1，CYP3A4*1G，ABCB1基因型分布频率及瑞芬太尼用量

2.3 基因型与瑞芬太尼剂量和泵速的关系 本研究中OPRM1 AA/AG，CYP3A4*1G TT,ABCB1 TT基因型患者共54例，麻醉过程中应减低瑞芬太尼剂量，严格控制静脉泵注速度；118例OPRM1 GG，CYP3A4*1G CC，ABCB1 CC基因型患者，术中麻醉维持中根据其麻醉程度适当提高瑞芬太尼剂量和泵注速度；100例CYP3A4*18B AG/GG基因型患者适当减少瑞芬太尼剂量，降低静脉泵注速度。由于CYP3A4*18B AG/GG基因型患者人群中占比1.91%，故表2中未纳入该等位基因型别，当遇到该基因型患者时适当减少瑞芬太尼剂量，降低静脉泵注速度[6]。

3 讨论

瑞芬太尼为超短效μ型阿片受体激动剂，其镇痛作用及副作用呈剂量依赖性，关于麻醉药物瑞芬太尼耐药位点的研究显示，由μ-阿片受体基因（OPRM1）编码的μ-受体是大多数内源性和外源性阿片物质作用的主要靶点，因此OPRM1也是药物遗传差异的主要候选基因[7]，达到同样的镇痛效果，携带OPRM1(118A＞G)G等位基因的患者会消耗更多的阿片类药物[8]。根据本研究基因位点检测结果评估瑞芬太尼预期药量结合临床实际用药，表明OPRM1(118A＞G)GG基因型患者较AA/AG基因型需更高剂量才能达到镇痛效果。

细胞色素P450酶（cytochromeP450，CYP450）在肝脏和肾上腺微粒体中含量丰富，是主要的药物代谢酶，其基因多态性参与阿片类药代谢的一相反应，对药物的吸收、代谢及口服药的首过消除都有重要作用[9]。CYP3A4基因是 CYP450超家族中表达最为丰富的酶，CYP3A4酶活性为单态分布，其机体内含量或活性改变均可引起药物的代谢动力学或药效学改变，从而产生个体差异[10]。阿片类药物主要在肝脏和小肠内由CYP3A4酶代谢成几乎无活性物质，CYP3A4*1G及CYP3A4*18突变可以改变CYP3A4酶的活性，因此与术后镇痛效应相关[11]。有研究发现，CYP3A4*1G(25343C＞T)TT基因型腹部手术患者术后48h阿片类药物用量明显低于CC型患者（20%～40%）[12]，提示CYP3A4*1G基因多态性是引起术后阿片类药物镇痛效应个体差异的主要遗传因素[13]。另有报道，对于胃切除术后患者，CYP3A4*18B(A＞G)GG基因型患者，可使用较低剂量的阿片类药物，而对于AA患者，则需使用较高剂量[14]。本研究发现，CYP3A4*1G(25343C＞T)TT型基因患者和CYP3A4*18B(A＞G)GG基因型患者消耗瑞芬太尼少于野生型患者。

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gP）是ABCB1 (MDR1)编码的一种分子量170KD的跨膜糖蛋白，既能与药物结合，又能与ATP分子结合，具有能量依赖性“药泵”外排的作用，P-gP减低了细胞内药物浓度，使细胞产生耐药性[15]。研究证明术后患者ABCB1基因多态性，与许多药物的体内代谢相关，会影响阿片类药物的使用剂量[16]。此外，吴成凤等[17]人报道，ABCB1基因T等位基因携带者所需阿片类药物使用量显著减少，可能与ABCB1基因C3435T多态性影响了阿片类药物进入中枢神经系统的能力有关。本次研究发现，ABCB1(3435T＞C)TT基因型患者，使用阿片类药物剂量明显低于CC基因型患者，与文献报道相符[18]，提示TT型转运蛋白活性减弱，阿片类药物外排能力减弱，药物应答更为敏感。

随着精准医学及药物个体化治疗的发展进步，检测技术和手段日益更新换代，荧光探针原位杂交技术其原理是将荧光素（或生物素、地高辛等）直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，通过检测荧光信号而进行定性、定量分析，具有灵敏度高、试验周期短、操作安全、被污染几率小、对实验环境要求低等优势。将荧光探针原位杂交技术用于手术患者麻醉药物使用的评估中，充分了解麻醉药物基因组学的基本原理，掌握用药的个体化原则，根据病人的不同基因型的特性进行合理用药，以达到提高药效、降低毒性和防止不良反应发生的目的。