EB病毒Rta优势表位抗原的克隆表达及在应用ELISA诊断鼻咽癌中的价值

张 玲，刘 杰，王臣玉，张守信，杨丽萍，危 利，王超男，焉丽波，宋少峰，陈蒙蒙，冯晓燕，张贺秋

［1.东方海洋（北京）医学研究院，北京 100071；2.烟台毓璜顶医院，山东烟台264000； 3.艾维可生物科技有限公司，山东烟台264000］

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）是能普遍感染人类且与多种恶性肿瘤发病有密切关系的DNA疱疹病毒[1]。EBV相关的恶性肿瘤包括Burkitt淋巴瘤、移植后B细胞淋巴增殖性疾病、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴增殖性疾病和NK细胞淋巴瘤/白血病、鼻咽癌、胃腺癌、平滑肌肉瘤等。国际癌症研究中心1999年致癌因子的分类标准中明确将EB病毒列为第1类致癌物，尤其是鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）。NPC是第一个被发现与EB病毒感染密切相关的人类癌症[2-3]。NPC在世界大部分地区发病率不到1/10万，但是约80%的鼻咽癌病例在中国，尤其是广东省，发病率高达（15～50）/10万，每年最少有80 000例新患者，死亡率达（10～13）/10万，成为一种区域性的高发肿瘤，因此我国已经将鼻咽癌列为重点预防和治疗的恶性肿瘤之一[4]。

鼻咽癌患者一般平均在症状出现前三年血清EB抗体水平呈持续升高或保持高滴度，这一血清学特征有助于鼻咽癌患者进行早期筛查和诊断[5]。EBV感染后在不同的周期产生不同的抗原，立即早期蛋白Rta是病毒由潜伏期到裂解期转变时，由立即早期基因BRLF1编码的605个氨基酸产物，是EBV由潜伏期转向裂解期的关键性调控因子，它能引起一系列的裂解早期基因的相继表达，最终引发EBV裂解感染[6]。2012年卫生部临床检验中心新增EBV Rta蛋白抗体IgG检测项目，用于辅助鼻咽癌的早期诊断。但是，目前获得批准的Rta-IgG抗体检测试剂较少，难以满足临床需求。为此，本研究首先利用生物学软件分析Rta氨基酸序列的B细胞表位分布及疏水性，选取含有优势表位的抗原区段；然后进行克隆表达并初步评价了其在鼻咽癌诊断中的价值，以期能够为Rta-IgG抗体检测试剂研制提供关键原料抗原。

1 材料与方法

1.1 研究对象 50例经临床病理确诊的NPC患者血清样本和90例健康体检者血清样本由烟台毓璜顶医院提供，保存于-80℃备用。

1.2 仪器与试剂 核酸蛋白检测仪（上海骥辉科学分析仪器有限公司），酶标仪（Thermo公司），pBVGST-6His载体质粒为由艾维可生物科技有限公司构建并保存，T4DNA连接酶（TaKaRa公司），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa公司），DNA限制内切酶（Promega公司），HRP标记的二抗（Bethyl公司）。

1.3 方法

1.3.1 Rta抗原表位分析及优势表位抗原区段的确定：从Genebank下载EB病毒Rta蛋白的氨基酸序列，采用BIOSUN生物信息学软件分析Rta蛋白氨基酸序列，利用B细胞表位分析功能，确定优势表位区段。采用Godenkey软件基因密码子优化功能，分析Rta优势表位抗原区段编码基因，根据密码子的简并性，采用大肠埃希菌优势密码子替换稀有密码子，并降低GC含量，最终确定Rta目的基因。

1.3.2 Rta优势表位抗原基因克隆与表达：Rta目的基因的合成及序列测定由中美泰和生物技术有限公司完成。XhoⅠ和XbaⅠ双酶切Rta目的基因及pBVGST-质粒，经连接转化构建重组pBV-Rta。测序后，将含有正确目的基因的大肠埃希菌菌株进行诱导表达。

1.3.3 抗原纯化及制备：收集诱导后的菌体，超声破碎，从表达菌中提取包涵体，收集粗提的包涵体进行Ni柱纯化。首先用平衡缓冲液（25mmol/L Tris-HCl，0.1%β-巯基乙醇，6mol/L脲，pH8.5）平衡Ni柱，将粗提的包涵体变性后过Ni柱，然后用含25mmol/L和250mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，SDS-PAGE鉴定目的蛋白所在的洗脱峰。

1.3.4 间接ELISA法建立及抗原活性鉴定：纯化的Rta优势表位区段抗原pBV-Rta用碳酸盐缓冲液稀释，浓度为2.5μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次，200 μl/孔；110 μl/孔封闭液室温封闭6 h；用洗液洗板5次，200μl/孔；每孔加入100μl样品稀释液后，分别加入10μl待测血清，室温孵育30 min，洗板5次，拍干；分别加入100 μl/孔HRP标记的抗人IgG，IgA和IgM，室温孵育20min；用洗液洗板5次，200 μl/孔，拍干；加新鲜配制的底物溶液，100 μl/孔，室温避光孵育10 min；加入50 μl/孔2 mol/L H2SO4终止反应；A630nm/A450nm双波长读取吸光度A值。

1.4 统计学分析 运用GraphPad Prism 5软件对检测结果进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，绘制ROC曲线，以约登指数最大判断Cut off值（临界值），≥Cut off值判定为阳性，＜Cut off值判定为阴性，并计算灵敏度与特异度。

2 结果

2.1 Rta抗原表位分析及优势表位目的基因的确定 BIOSUN生物信息学软件分析Rta蛋白氨基酸序列，见图1。选取抗原性最好的301～440aa区段作为Rta优势表位抗原区段。采用Godenkey软件分析Rta优势表位抗原区段编码基因，发现其中含有25个大肠埃希氏菌表达系统稀有密码子，所占比例为17.86%。同时Rta优势表位抗原编码基因的GC含量较高为61.67%，局部区段高达80%以上，影响基因的合成与扩增。因此，根据密码子简并性原则对其进行优化，将稀有密码子变换为适宜在大肠埃希菌表达的优势密码子，并适当降低GC含量至58.09%，且不再含有局部高GC含量区域。

图1 EB病毒Rta蛋白的B细胞表位分析

2.2 Rta优势表位抗原表达、纯化与鉴定 测序正确的重组质粒pBV-Rta转化于大肠埃希菌诱导表达，Rta优势表位抗原为包涵体表达，Ni柱纯化后获得纯化抗原，经SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示Rta优势表位抗原相对分子量约为33kDa，见图2。

图2 Rta优势表位抗原SDS-PAGE电泳鉴定

2.3 Rta优势表位抗原活性初步评价 随机选取10份临床病理确诊的NPC患者血清样本和10例健康体检者血清样本，通过间接ELISA法对其进行检测，结果见表1。

表1 Rta优势表位抗原活性初步评价

Rta优势表位抗原在抗体检测中具有非常优异的特异性，10例健康体检者血清样本均检测为阴性。IgG抗体检测优于IgA抗体检测，可以区分NPC患者和健康对照。IgM抗体检测NPC患者和健康对照均为阴性，无法进行区分。

2.4 NPC患者血清中Rta-IgG抗体检测 通过间接ELISA法对50例经临床病理确诊的NPC患者血清样本和90例健康体检者血清样本进行抗Rta-IgG抗体检测，见图3。NPC 患者血清中抗Rta-IgG水平显著高于健康对照组（P＜0.001）。根据ROC曲线，抗Rta-IgG诊断NPC的AUC值为0.860。以约登指数最大时的A450nm=0.246为临界值，抗Rta-IgG对NPC检测的灵敏度为73.08%，特异度为95.79%。

图3 Rta优势表位抗原血清学检测性能

3 讨论

由于EBV感染与鼻咽癌密切相关，与健康成人比较，鼻咽癌患者血清中各种EBV抗体水平普遍较高，并且在鼻咽癌临床症状出现之前即可检出。但是根据我国流行病学资料，几乎所有40岁以上的人群均感染过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。因此用于鼻咽癌筛查和鉴别诊断的体外诊断试剂需具备高特异性，同时多靶标联合检测在保证特异性基础上提高检出率也是业内共识[7-8]。近年研究表明，联合检测Rta-IgG，VCA-IgA和EBNA1-IgA三种抗体能够明显提高临床对NPC患者的早期筛查与诊断效能，具有重要的临床应用价值[9]。

由EB病毒BRLF1编码的Rta蛋白属于立即早期蛋白，当EBV从潜伏感染转变为裂解感染时首先启动Rta表达，然后引发一系列级联反应，促使病毒从潜伏状态进入增殖状态。由于Rta表达早，且是EBV进入裂解复制状态必需的激活元件，所以检测Rta抗体有助于早期发现NPC患者。为了自主研发高检测性能的Rta抗体检测试剂，本研究选取Rta优势表位301～440aa，与先前研究认为Rat蛋白的表位主要位于蛋白的羧基端2/3部分（179～605aa）相一致[6,10]。该优势表位区段与自主构建的pBVGST-6His进行连接，成功构建了原核表达质粒pBV-Rta，诱导后其为包涵体表达，Ni柱纯化得到高纯度的pBV-Rta抗原。pBVGST-6His载体以pBV220载体为骨架，融合了GST标签使得目的蛋白更容易表达，同时增加了His标签，使得目的蛋白更容易纯化。此外，由于pBV220是热诱导表达载体，在抗原规模化生产时还可以降低成本。

经过小样本验证，确定本研究制备的Rta优势表位抗原对IgG和IgA抗体具有高检测性能，尤其是IgG，可以很好地区分NPC患者与健康对照血清样本。Rta蛋白血清抗体主要有IgG和IgA，IgA抗体能反映病毒近期感染的情况，但IgG抗体的半衰期比IgA抗体更长，为保证足够的灵敏度对于周期时间较短的立即早期蛋白应选择IgG抗体，故目前临床上常采用Rta-IgG抗体作为筛查指标，且一致认为血清Rta-IgG抗体是较为适合NPC初期筛查及诊断的指标之一[11-13]。

FENG等[13]研究获得两种原核表达的Rta重组融合蛋白质，即BRLF1-185I（187～356aa）和BRLF1-150I（384～534aa）两个片段，并将两种融合蛋白混合作为抗原，以间接ELISA的方法，分别检测了51例鼻咽癌病人和47例正常对照组血清样品中Rta-IgG，灵敏度为82.3%，特异度为85.2%。本研究仅选取一个优势表位区段301～440aa，Rta-IgG检测方法灵敏度和特异度分别为73.08%和95.97%，诊断性能高，特异度显著优于文献报道，这可能是由于该段区域为优势表位区段抗原，含有高活性抗原表位，另一方面又去除了与人类蛋白质高度同源的区域[14]，因而具有更高的特异度。

本研究制备的Rta优势表位抗原产量高、纯度高、活性好、特异度高，基于Rta优势表位抗原建立的Rta-IgG间接酶联免疫检测方法具有很好的检测性能，为自主研发高质量Rta-IgG抗体检测试剂奠定了基础。