2型糖尿病患者锰超氧化物歧化酶Ala-9Val基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性研究

何晓一，李春燕(中国人民解放军联勤保障部队第九八七医院.内分泌科；.消化内科,陕西宝鸡 721000)

颈动脉粥样硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者最常见的大血管并发症，亦是导致T2DM患者死亡的主要原因，因此有效控制颈动脉粥样硬化（Carotid atherosclerosis CAS）对改善T2DM患者的预后和生活质量具有积极的作用。研究结果表明氧化应激水平的异常在糖尿病发生和发展过程中发挥着重要的作用[1-3]。锰超氧化物歧化酶(manganesesuperoxide dismutase,Mn-SOD)是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的同工酶，其是机体重要的抗氧化酶之一，近年来有研究指出Ala-9Val是Mn-SOD基因多态性位点，该位点基因型差异可直接影响Mn-SOD构象及生物学活性。目前已有大量关于Ala-9Val位点单核苷酸多态性(single nucleotid e polymorphism,SNP)与糖尿病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病等相关性分析的文献报道[4-6]，但是鲜有其SNP与CAS相关性的研究报道，基于此本研究通过比较不同患者Mn-SOD基因Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率的差异，旨在探讨Mn-SOD基因多态性与T2DM及CAS的相关性，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取我院2017年1月～2019年1月310例T2DM患者为T2DM组，其中男性181例，女性129例；平均年龄56.09±9.81岁，根据颈动脉超声检查结果又分为无CAS亚组和CAS亚组。另选取同期我院体检健康的160例志愿者作为对照组，其中男性94例，女性66例；平均年龄55.74±9.90岁。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有受试者均自愿参加且签署知情同意书。

收集受试者的一般资料，主要包括体重指数(body mass index,BMI)、高血压病史、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin,GHb)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等。

T2DM组纳入标准：①年龄≥18岁；②严格参照中华医学会糖尿病学分会指定的《中国2型糖尿病防治指南》(2013年)诊断为T2DM者[7]；③糖尿病病程大于5年者。

T2DM组排除标准：①1型糖尿病者；②并发严重肝肾疾病、恶性肿瘤和风湿免疫系统疾病者；③妊娠期女性。

1.2 仪器与试剂 DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR仪购自德国Eppendorf公司。采用日本东芝公司智能彩色多普勒超声仪(Aplio 500型)测定颈动脉内中膜厚度值(carotidintimamedia thickness,CIMT)。

1.3 方法 颈动脉超声检查：受试者取仰卧位，采用智能彩色多普勒超声仪检测颈总动脉分叉处及分叉处远端和近端各1～1.5cm处的CIMT值，取左右两侧较大值作为该受试者CIMT结果。本研究定义CIMT≥1mm或颈动脉斑块形成为CAS，并以此标准将T2DM组患者分为无CAS亚组和CAS亚组。

基因多态性检测：①基因组DNA提取：清晨采集受试者空腹外周静脉血3 ml，采用DNA提取试剂盒严格按照说明书上的操作步骤提取全血基因组DNA。②PCR扩增：严格按照PCR操作流程，上、下游引物分别为5’-CAGCCCAGCCTGCGTAGACG-3’；5’-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3’。③酶切和电泳：取延伸产物采用限制性内切酶BsaW Ⅰ进行酶切，再取酶切产物进行电泳，凝胶成像系统判定结果。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以n（%）表示。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。多因素分析采用Logistic回归分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间一般资料的比较 见表1。相较于对照组，T2DM组患者的CIMT，FPG和LDL-C值均显著升高，其差异具有统计学意义(P＜0.05)，两组的BMI，吸烟、高血压、GHb，TG，TC和HDL-C差异无统计学意义(P＞0.05)。另外，相较于无CAS亚组，CAS亚组患者的CIMT，GHb，TG和TC均显著升高，其差异具有统计学意义(P＜0.05)，两组的BMI，吸烟、高血压、FPG，LDL-C和HDL-C差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各组Mn-SOD基因Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率的比较 见表2。研究发现在Mn-SOD基因Ala-9Val位点共有3种基因型，分别为Val/Val，Ala/Val和Ala/Ala基因型。对照组和T2DM组的Ala-9Val位点基因型差异无统计学意义(χ2=4.210，P=0.122)，两组的等位基因分布频率差异具有统计学意义(χ2=4.487，P=0.034)。CAS亚组与无CAS亚组的Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率差异均具有统计学意义(χ2=12.283，P=0.002；χ2=10.984，P=0.001)。

2.3 T2DM患者发生CAS的危险因素分析 见表3。结合上述实验结果，以GHb，TG，TC和Ala-9Val位点Val/Val基因型为自变量，采用Logistic多因素回归分析法，结果显示Ala-9Val位点Val/Val基因型是T2DM患者发生CAS的独立危险因素(OR=1.865，95%CI 1.086～3.200，P=0.007)。

表1 各组间一般资料的比较[±s,M(P25,P75)]

表1 各组间一般资料的比较[±s,M(P25,P75)]

项目 对照组(n=160) T2DM组(n=310) χ2P T2DM组 χ2P CAS亚组(n=186) 无CAS亚组(n=124)BMI(kg/m2) 23.85±3.16 24.22±3.11 0.118 0.908 24.35±3.04 24.01±3.26 0.130 0.718吸烟[n(%)] 70(43.75) 147(47.42) 0.326 0.754 90(48.39) 57(45.97) 0.325 0.569高血压[n(%)] 68(42.50) 155(50.00) 0.375 0.707 100(53.76) 55(44.35) 0.139 0.933 CIMT(mm)] 0.70(0.50,0.80) 1.40(0.90,2.20) 10.984 0.001 2.00(1.70,2.70) 0.80(0.60,0.90) 7.869 0.005 FPG(mmol/L) 5.53±1.86 9.26±2.10 12.283 0.002 9.40±2.02 9.06±2.21 3.037 0.219 GHb(%) 5.14(4.86,5.82) 6.02(6.35,9.02) 0.406 0.687 9.24±1.94 6.34±2.05 4.063 0.044 TG(mmol/L) 2.20±0.64 2.27±0.59 0.125 0.903 5.33±0.58 2.18±0.62 8.644 0.003 TC(mmol/L) 4.66±1.05 4.84±0.98 4.210 0.122 5.93±0.94 4.39±1.03 4.487 0.034 LDL-C(mmol/L) 3.05±0.95 5.45±0.98 7.865 0.005 3.47±0.85 3.42±0.92 0.406 0.687 HDL-C(mmol/L) 1.14±0.36 1.09±0.35 4.487 0.034 1.06±0.33 1.13±0.38 4.210 0.122

表2 各组Mn-SOD基因Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率比较

表3 T2DM患者发生CAS的危险因素分析

3 讨论

已有大量研究表明机体氧化还原水平失衡与T2DM的发生、发展密切相关[8-10]，SOD是一类广泛存在于生物体内的金属酶，是机体重要的抗氧化物质，与过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)相互作用共同维持机体的超氧离子处于较低水平。SOD主要是以Fe-SOD，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD等形式存在于细胞质、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体内。Mn-SOD主要分布于细胞线粒体基质内，其是机体主要的自由基清除剂之一，对维持机体细胞氧化还原平衡具有重要作用。有研究指出T2DM患者血清Mn-SOD活性显著低于正常对照组，且并发糖尿病视网膜病变/糖尿病肾病患者血清Mn-SOD活性水平较单纯糖尿病患者下降地更为显著[11-12]，由此可提示Mn-SOD与多种疾病密切相关。

目前，Ala-9Val是Mn-SOD基因单核苷酸多态性位点，例如GCT→GTT点突变可将Mn-SOD线粒体靶序列第9位的氨基酸由丙氨酸替换为丝氨酸，进而导致信号肽构象由亲水的α-螺旋结构转变为疏水的β-折叠层结构，阻碍Mn-SOD在线粒体膜上的转运，显著降低Mn-SOD活性。大量研究结果显示Ala-9Val位点多态性与糖尿病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、冠心病、精神分裂症等的临床易感性密切相关，充分证实该位点基因多态性具有实际生物学功能[13]。然而，该位点基因多态性与CAS的相关性鲜有报道。

本研究选取我院310例T2DM患者和160例健康体检志愿者为研究对象，分别检测和比较其Mn-SOD基因Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率，结果显示对照组和T2DM组等位基因分布频率的差异具有统计学意义，两组的Ala-9Val位点基因型分布频率差异无统计学意义。该结果与相关文献报道不同，究其原因可能与本研究纳入样本量相对较少和纳入排除标准不同有关。本研究进一步探讨了T2DM患者CAS亚组和无CAS亚组Ala-9Val位点基因型和等位基因的分布频率，结果显示两组Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率差异均具有统计学意义。由于Val/Val基因型是各组中分布频率较高的Ala-9Val位点基因型，最后采用多因素Logistic回归分析法分析T2DM患者发生CAS的危险因素，结果显示携带Val/Val基因型是T2DM患者发生CAS的独立危险因素。

国内外研究结果表明不同地区、不同种族人群Ala-9Val位点基因型和等位基因分布频率存在显著差异，亚洲人群中Ala等位基因分布频率显著低于欧洲人群[14-16]。接下来本课题组计划扩充纳入样本的数量、区域以更全面和科学地反映Ala等位基因分布频率与各种疾病发生发展的关联性。

综上所述，Mn-SOD基因Ala-9Val多态性与T2DM患者CAS相关，携带Val/Val基因型可能成为预测T2DM患者出现CAS的新指标。