深圳地区人群乙型肝炎病毒携带者HLA-DRB1等位基因多态性及关联性分析

杨小柯，何柳媚，全湛柔，高素青

（1.深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518000；2.深圳市血液中心输血医学研究所,广东深圳 518000）

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC被称为人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），该系统是目前已知人体最复杂的多态系统。HLA基因复合体是首个被发现的与疾病有明确关系的遗传系统[1]。研究发现许多疾病与某些HLA等位基因或HLA单倍型呈现明显的相关性，其中最有意义的就是HLA-B*27与强直性脊柱炎的相关性[2-6]。HLA的大部分基因和免疫系统相关，特别是II类区域几乎所有基因均显示免疫相关功能[7]。乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染后表现出的不同疾病过程取决于个体的免疫反应状况，众多流行病学调查资料表明，HBV感染与宿主的种族、免疫状态和遗传因素有关。而HLA直接参与免疫反应。其中，HLA-II类分子主要分布在抗原呈递细胞(APC)和T淋巴细胞表面。CD4+T淋巴细胞表面上的TCR受体识别HLA-II类分子并与提呈的抗原肽结合，是启动CD4+T淋巴细胞免疫活化的关键步骤。活化的CD4+T淋巴细胞可分泌促细胞毒性T淋巴细胞（CTL）生长与分化的淋巴因子，激活CTL和自然杀伤细胞（NK细胞），参于抗HBV的应答。HLA-DRB1是经典的HLA-II类基因。既往对乙肝病毒携带者中的HLA多态性的分析研究多采用血清学方法[8]，聚合酶链反应-直接测序分型法（PCR-SBT）是如今研究的主流技术。深圳地区HLA-DRB1与HBV携带者的相关性至今尚未见有报道，笔者所在实验室对HLA-DRB1基因多态性与乙型肝炎病毒携带者之间的相关性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 研究对象 以无症状的163例深圳地区汉族人群乙型肝炎病毒携带者作为研究对象（年龄为18～60岁，酶联免疫法和核酸转录介导扩增技术两种方法检测乙型肝炎表面抗原均为阳性），正常对照组为随机抽取的314例无血缘关系的深圳地区健康汉族人群（年龄18～60岁，酶联免疫法和核酸转录介导扩增技术两种方法检测乙型肝炎表面抗原均为阴性，无其它病毒性肝炎、自身免疫性疾病等）。携带组和对照组参与者均对实验知情同意，并经深圳市血液中心医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 全自动核酸提取仪（MagCore HF16，台湾瑞宝公司），PCR仪（9700型，美国ABI公司），测序仪（3730型，美国ABI公司），核酸提取试剂（台湾瑞宝公司），HLA基因测序分型试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 使用全自动核酸提取仪（MagCore HF16，台湾瑞宝公司）和提取试剂（台湾瑞宝公司）提取外周血白细胞中基因组DNA，DNA浓度在20～100ng/ml，纯度在1.6～2.0。

1.3.2 采用商品化测序分型试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），按试剂盒说明书先进行扩增、扩增产物纯化，再进行测序反应、测序反应产物纯化，最后用测序仪（3730型，美国ABI公司）进行毛细管电泳。收集原始数据后，使用uTYPE7.2版（HLA SBT uTYPE 7.2CMDP）软件分析，并最终得到携带组和对照组的HLA-DRB1基因分型结果。

1.4 统计学分析 采用直接计数法计算携带组和对照组的HLA-DRB1等位基因频率，结果进行Hardy-Weinberg吻合度检验。两组间等位基因频率比较采用SPSS Statistics 20统计软件（IBM公司）进行χ2检验。

2 结果

携带组和对照组的HLA-DRB1等位基因观察值与期望值差异无统计学意义，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。乙肝病毒携带组及健康对照组的HLA-DRB1等位基因频率分布见表1。可见，对照组检出的HLA-DRB1等位基因有32种，其中占比大于5%的基因型有6种，为HLADRB1*09:01（16.40%），12:02（11.15%），15:01（9.87%），08:03（8.91%），11:01（6.05%），04:05（5.10%）；携带组中检出的HLA-DRB1等位基因有28种，其中占比大于5%的基因型有6种，为HLA-DRB1*09:01（20.55%），12:02（14.72%），15:01（9.20%），03:01（7.06%），08:03（5.52%），11:01（5.21%）。其中，携带组中HLA-DRB1*03:01检出率高于对照组，差异有统计学意义（P=0.010）。

3 讨论

HBV是引起乙型肝炎的病原体，HBV感染是全球性的公共卫生问题。我国人群具有特殊的肝病背景，HBV携带者在人群中比例高达10%。HBV的发病原因、感染控制等一直是科研工作的热点。

机体抗病毒免疫功能及病毒逃避免疫攻击的能力决定着HBV感染的发生、发展和转归[9]。ZENIYA等[10]通过研究认为免疫遗传背景是决定HBV感染疾病易感性的重要因素之一。HLA基因多态性影响着免疫应答和抗原递呈，从而导致机体免疫功能状态的差异。某些特殊的HLA基因型可能影响着HBV感染的慢性化和免疫反应的强弱[11-13]，从而导致HBV感染后结局的不同。HLA-II类抗原主要分布于B细胞，抗原呈递细胞和激活的T细胞表面，参与呈递外来抗原给CD4+T细胞（MHC限制）[14]。WEISSMAN等[15]认为造成无应答状态的原因与携带有关HLA基因者难以将HBsAg信息提呈给T细胞，并产生抗体有关。HLA-II类分子中HLA-DRB区的多态性最为复杂[16]。近年来，国内外学者对HLA-DRB1基因多态性和不同疾病关系的研究相对较多。ZHU等[17]发现HLA-DRB1等位基因对湖北汉族人群肾综合征出血热有影响；FAINBOIM等[18]的研究认为DRB1*13:01与慢性甲肝感染密切相关；SHI等[19]通过实验得出HLADRB1*15与中国北方汉族人群肺结核相关的结论；THURSZ等[20]对冈比亚人群的研究表明，HLADRB1*13:02与HBV感染的自发清除有关，可能对机体抗HBV感染具有保护作用，随后这一结果在韩国[21]、德国[22]以及高加索[23]人群的研究中陆续得到证实。但是国内针对HBV与HLA-DRB1的研究却显示出了不同的结果，山东的袁俊华[24]发现HLA-DRB1*12:01/15:01可能是慢性乙型肝炎HBV携带者的易感基因；宋明胜等[25]的研究结果显示HLA-DRB1*04:01为HBV慢性感染的一个易感基因；邢文斌等[26]研究发现HLA-DRB1*13:01与乙型肝炎病毒的清除有关，HLA-DRB1*07:01，03:01，02:01与乙型肝炎病毒慢性感染有关。

表1 乙肝病毒携带组与健康对照组HLA-DRB1等位基因的数量及频率分布检出数[频率(%)]

不同人种、不同地区人群的HLA基因存在很大差异，深圳地区人群HLA-DRB1与HBV携带者的相关性至今尚未见有报道，为探讨深圳地区人群对HBV的易感性是否与HLA-DRB1等位基因有关，本研究选取HBV携带者（携带组）和健康人群（对照组）进行HLA-DRB1基因检测并进行统计学分析，结果显示，携带组中HLA-DRB1*03:01检出率高于对照组，差异有统计学意义（P=0.010）。提示深圳地区人群感染乙肝病毒的机会与HLADRB1*03:01呈正相 关，HLA-DRB1*03:01可 能是乙肝病毒的易感基因。此结果与钱燕华等[27]用Meta分析的方法综合评价9篇病例对照研究文献后得出的结论一致，即HLA-DRB1*03等位基因与我国汉族人群慢性乙型肝炎的发生具有显著的统计学关联，为易感基因。

HLA-DRB1*03:01等位基因与免疫相关疾病的关系已被多个研究证实[28-30]，本研究结果说明，HLA-DRB1*03:01等位基因与HBV感染亦存在关联。HLA-DRB1*03:01在HBV感染后是如何发挥免疫学方面作用的，是否要对携带此基因的人群增强HBV抗感染免疫，还有待于进一步的研究。