广西壮族自治区人群华支睾吸虫感染与MN血型基因的相关性研究

唐雄驰，徐庆萍，韦小荣，黄克河，江 毅，施超园，梁延连

（1.贵港市平南区人民医院，广西贵港 537300；2.广西医科大学附属武鸣医院；南宁 537000； 3.深圳市血液中心输血医学研究所,广东深圳 518000）

华支睾吸虫（又称肝吸虫，以下统称华支睾吸虫）的感染与流行是中国南方地区关注的流行病，其中以广西、广东和海南等省(自治区)为华支睾吸虫病的主要流行区。华支睾吸虫又称华肝蛭，成虫寄生于人体的肝胆管内，对人的肝胆管造成病变损害，虫体主要摄取宿主的红细胞与白细胞。成虫在肝胆管内破坏胆管上皮及黏膜下血管并不断排出代谢产物和分泌有毒物质，引起胆管内膜及胆管周围的超敏反应与炎症反应，出现胆管局限性的扩张及胆管上皮增生，由于胆管壁增厚，管腔狭窄和虫体堵塞胆管，可出现胆管炎与胆囊炎或阻塞性黄疸，

由于胆汁流通不畅，往往容易并发细菌感染。华支睾吸虫的幼虫在肝实质移行或在腹腔器官内移行时会刺激宿主肌体产生炎症应答，激发免疫应答产生IgM与IgG抗体。病理研究表明，受华支睾吸虫感染的胆管呈腺瘤样病变，感染严重时在门脉区周围可出现纤维组织增生和肝细胞的萎缩变性，甚至形成胆汁性肝硬化。广东、广西等地区的人群均有喜欢吃“鱼生”或“生滚鱼粥”的生活习惯，生吃海鲜有感染华支睾吸虫的危险[1]。有研究报道：人类的细胞因子与寄生虫感染息息相关，细胞因子是机体受内、外刺激而产生的免疫递质，它们既是免疫细胞的效应分子，又是细胞间传递信息、相互调节的分子通路[2]。与寄生虫相关的细胞因子主要包括白细胞介素群系（IL-1，IL-2，L-3……）、干扰素群系（IFNα，β，γ）、肿瘤坏死因子群系与转化生长因子等，其中细胞黏附分子属于跨膜糖蛋白，

这类型的跨膜糖蛋白是寄生虫感染的受体[3-4]。另外有报道：华支睾吸虫病人有红细胞免疫功能方面明显低下的症状，但体液免疫功能无明显改变[5]。据此，本研究对有相同饮食习惯的广西壮族自治区武鸣区与贵港平南区的15～65岁人群进行了随机筛查血清中华支睾吸虫IgG抗体，同时对寄生虫感染有密切关系的红细胞跨膜糖蛋白候选基因M，N，MG，MT的频率进行了调查研究，报道如下：

1 材料与方法

1.1 研究对象 样本来源以广西壮族自治区具有相同饮食习惯（生吃鱼肉）的武鸣区与贵港平南区作为代表性研究地区，随机抽选15～65岁原居住地人群，其中武鸣区700例，贵港平南区500例，共1 200例。分别采集3ml不抗凝血与3ml抗凝全血进行血清华支睾吸虫IgG抗体检测与红细胞跨膜糖蛋白相关候选基因M，N，MG，MT的频率调查。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂：由深圳华康生物医学工程有限公司生产的华支睾吸虫IgG抗体检测试剂盒（批号：20191103），定性检测人血清（浆）中特异性华支睾吸虫IgG抗体，抗体水平与感染水平呈正相关。单克隆鼠抗血清Anit-M(IgM性质，批号：20190709)，Anit-N(IgM性质，批号：20190428)均由上海血液生物科技有限责任公司提供，进行MN血型鉴定并统计M，N基因频率。Gentra DNA提取试剂盒（批号：106412）由美国Promega公司提供。基因测序选用引物[6]：上游：5’-CCACATAGCAATTCTCTAAAC-3’；下游：5’-GCATTTCTCAGTGTTTGTCAC-3’进行MG，MT基因分型与频率调查。

1.2.2 仪器：Vranus AE120酶联免疫分析仪，Eppendorf 9700 PCR扩增仪，PrismTMABl3730XL测序仪，Embitec电泳仪，D77WWL-20-M凝胶成像仪，Diamed-ID 12SI卡式离心机，Diamed-ID 37SI孵育器。

1.3 方法

1.3.1 血清华支睾吸虫IgG抗体检测：实验方法与结果的判断严格按试剂盒的步骤与要求进行。MN血型鉴定以血型血清学的抗原-抗体反应检测MM，MN，NN血型结果，同时计算M，N的基因频率。

1.3.2 DNA提取：使用Gentra试剂盒提取抗凝血样的DNA，并控制DNA的浓度在80～100ng/μl范围。

1.3.3 PCR加样体系与扩增条件：50μl加样体系：10×Buffer 5μl；MgCl23μl；dNTP 4μl；正 向 与反向引物各2μl；TaqDNA聚合酶1μl；DNA模板2μl；ddH2O 31μl。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃×1 min，56℃×1 min，72℃×1 min，共30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.4 扩增产物验证：取3μl扩增产物经2 g/dl琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段与产物的纯度。

1.3.5 产物纯化与测序鉴定：使用离心过滤柱法(Milliprore公司)纯化扩增产物，纯化后的扩增产物作为测序反应模板，再一次扩增，测序引物与第一次扩增引物序列相一致，采用10μl反应体系：正向与反向引物(终浓度为0.062 5pmol/L)各3μl；模 板DNA 1μl；ddH2O 2.0μ1；ABI Big-Dyev3.1测序反应液4μ1。PCR扩增条件：94℃预变性10min；94℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，运行25个循环后产物于4℃保存。以上扩增产物用醋酸钠/乙醇沉淀法提纯后使用PrismTMABl3730XL基因测序仪检测，并使用Oli6instatler分析软件进行测序结果分析。

2 结果

通过Vranus AE120酶联免疫分析仪对广西壮族自治区随机选取的武鸣区700例、贵港平南区500例共1 200例15岁至65岁人群的华支睾吸虫血清抗体检测，得到华支睾吸虫IgG抗体筛查结果：武鸣区的华支睾吸虫抗体阳性率62.7%（439/700），贵港平南区的华支睾吸虫抗体阳性率3.4%(17/500)，这说明两个区的华支睾吸虫感染阳性率具有明显差异。对1 200例人群的血样全部进行了红细胞跨膜糖蛋白候选基因M，N，MG，MT频率调查，见表1。从相关的基因调查暂时未发现与两区人群的华支睾吸虫感染有显著差异。MG，MT基因分型鉴定代表图见图1,图2。

表1 广西壮族自治区武鸣区与贵港平南区的华支睾吸虫感染调查结果

图1 MG血型基因鉴定位点

图2 MT血型基因鉴定位点

应用相同的试剂与检测仪器同时对武鸣区与贵港平南区人群的华支睾吸虫抗体检测结果显示，两个地区的人群都习惯食用“鱼生”或“生滚鱼粥”等生吃海鲜的习惯，但两地区的华支睾吸虫感染程度具有明显的不同，武鸣区的人群对华支睾吸虫感染具有高发的现象，而贵港平南区的人群对华支睾吸虫是低感染的现象，说明人群对华支睾吸虫的易感性未必与饮食习惯完全相关。另外，检测两地区人群的红细胞跨膜糖蛋白候选基因M，N，MG，MT基因频率未发现明显差异。

3 讨论

据调查研究发现，在亚热带地区生活的人群普遍都有一个共同的生活习惯：食用生的或烹饪未完全煮熟的淡水鱼。大部分淡水鱼类中携带有一种名为Clonorchis sinensis的蠕虫，这种蠕虫称华支睾吸虫，又称肝吸虫（liver fluke），它的成虫寄生于人或动物体的肝胆管内，可引起华支睾吸虫病（Clonorchiasis），又称肝吸虫病。受华支睾吸虫（以下统称华支睾吸虫）感染的人类或动物会表现出生长迟缓和各种并发性疾病：肝脏大量出血和炎症，胆管和胆囊增厚或扩张，较为严重的并发症是诱发肝脏发生恶性肿瘤[7-8]。当寄生虫初步感染时，会刺激肌体最先免疫出现的是IgM抗体，随着感染时间的延长会出现IgG抗体，如果在血清中检测到寄生虫的IgG抗体，说明肌体有曾经的感染史或正在感染华支睾吸虫。因此通过血清学检测的定性方法，可以追踪与定性华支睾吸虫的感染率。

研究中对我国南方地区具有相同喜好：吃“鱼生”或“半生鱼粥”生活习惯的广西壮族自治区武鸣、贵港两区进行华支睾吸虫的高发感染与低感染人群的频率与相关候选基因进行调查研究，以随机选取的方式对武鸣区700例、贵港平南区500例共1 200例的15～65岁人群进行华支睾吸虫抗体IgG抗体筛查，严格按照试剂盒说明书的操作进行血清抗体检测，每批次实验均设置阴性、阳性、空白对照孔，结果显示武鸣区的华支睾吸虫抗体阳性率为62.7%，贵港平南区的华支睾吸虫阳性率为3.4%。从数据上体现了具有相同饮食习惯的地区在华支睾吸虫的易感性上具有显著的差异。调查对像不分男性与女性，只选取15～65岁的人群，原因是同一地区或同一家庭中饮食相似，这个年龄段的人活动范围广、餐中食量大等共同特点。根据两区人群的高发感染与低感染率的差异，是否与不同地区人群的其他遗传基因相关有待进一步的深入研究。对于华支睾吸虫感染的研究，除了血清学检测已经被广泛应用外，人们逐步建立起标准化、准确性高的诊断测试来识别是否受感染，还有通过分子生物学技术在基因识别和表征来鉴别感染与致病的可能性，并且把分子生物学手段介入了寄生虫的治疗：Wannaporn Ittiprasert动物模型中，使用CRISPR/Cas9‘敲除’的基因导致寄生虫感染症状显著减少，通过他们的研究还表明，这种革命性的生物医学工程-CRISPR/Cas9是一项新技术，可以精确定位和灭活寄生虫所产生的特定蛋白质所需的遗传信息[9]。另外在华支睾吸虫感染与治疗方面，可以使用CRISPR/Cas9去除编码颗粒体的基因，使华支睾吸虫感染的症状明显减轻[9]。广西壮族自治区武鸣与贵港平南两区人群的寄生虫感染相关的红细胞跨膜糖蛋白候选基因：M，N，MG，MT基因的频率分布结果未发现该基因与华支睾吸虫感染密切相关，有待增加样本量深入鉴定寄生虫感染受体-红细胞跨膜糖蛋白对应的相关基因的碱基序列，以期深入了解华支睾吸虫对人群的易感性与耐受性。

研究发现，大部分的淡水鱼体内感染了华支睾吸虫，但虾类都不感染华支睾吸虫[10]。所以调查喜食“鱼生”或“生滚鱼粥”的广西壮族自治区武鸣与贵港平南区人群，得到的调查结果与别的地区报道有差异：中山市居民人群华支睾吸虫总感染率为19.45%[11]；佛山市华支睾吸虫感染率为33.89%[12]。调查结果显示广西武鸣区感染率与同乐乡（77.85%）较为相近[13]。从数据说明，我国各个地区的人群对华支睾吸虫的感染情况各有差异，文献报道的研究结果大多以人群的生活习惯：生食鱼类或其他海鲜类的原因确定为易感因素。然而，在不同居住地但有相同饮食习惯的广西壮族自治区武鸣区与贵港平南两区的人群存在高发率与低感染率的明显差异，这是否与人群中不同的基因或血液中的黏附因子相关有待进一步深入研究，这项展望也是课题下一步探讨的方向，研究结果可以为华支睾吸虫的预防与治疗打下基础。