雄激素及其受体在有氧运动改善肥胖及肥胖相关疾病症状和血糖血脂中的作用

2020-12-04尹利军杨亚南林小晶王晓慧

中国运动医学杂志 2020年7期

尹利军杨亚南林小晶王晓慧

上海体育学院运动科学学院（上海200438）

肥胖（obesity，OB）及肥胖相关疾病如糖尿病（diabetes mellitus，DM）和动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）严重威胁着人类健康，糖尿病可引起心脑血管并发症的发生，动脉粥样硬化亦是诱发中风的主要因素。探索有效防治肥胖及其相关疾病的方法及其机制备受关注。以血糖血脂异常为主要特征的糖、脂代谢紊乱是肥胖及其相关疾病发生与发展的主要原因，因此，改善异常的血糖血脂水平是防治肥胖及其相关疾病的中心环节。

雄激素除了可促进和维持男性性征、肌肉质量力量及骨代谢稳态[1]之外，在调节糖、脂代谢稳态中也发挥了重要作用，且该作用主要通过雄激素受体（androgen receptor，AR）介导。AR 作为一种转录核受体，除了在性腺器官中高度表达之外，还表达在肝脏、骨骼肌和脂肪等组织中，它的表达与活性对机体代谢有着重要影响[2，3]。雄激素/AR 受抑制是导致男性出现糖、脂代谢紊乱，诱导肥胖及其相关疾病发生与发展的原因之一[4]。动物实验结果表明，血清睾酮水平和/或AR水平低下的雄性小鼠出现了肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常（异常升高的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平，以及显著减少的高密度脂蛋白）[5，6]；临床研究发现，性腺机能减退的青年男性或睾酮水平低下的老年男性均出现了不同程度的糖、脂代谢紊乱和更高的糖尿病患病风险[7]，且外源补充雄激素可显著降低内脏脂肪量、腰臀比、胰岛素抵抗水平，以及罹患肥胖、AS等疾病的风险[8-10]。但由于长期外源补充雄激素可能会诱发较多副作用（如增加前列腺炎甚至前列腺癌、肝癌等的患病风险）而不被广泛使用[11]。

雄激素/AR 在肥胖及肥胖相关疾病的血糖血脂紊乱中的作用，与其调控糖、脂代谢关键蛋白和关键酶的表达与活性有关。例如，雄激素/AR受抑制的睾丸雌性化小鼠和雄激素水平低下的2型糖尿病雄性小鼠出现糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸激酶（phosphoenolpyruvate carboxy kinase，PEPCK）的升高（PEPCK 升高是胰岛素抵抗的一大诱因）及促进葡萄糖摄取的葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT4）的降低，且PEPCK和GLUT4的异常均能被外源补充雄激素所逆转[12，13]。再如，去势小鼠（去除睾丸，使雄激素水平降至很低水平）被发现内脏脂肪的异常沉积，且脂肪组织中的脂肪水解关键限速酶—脂肪甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）和脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）均显著下降[14]。ATGL是脂肪内TG分解的关键限速酶[15]，LPL是血液中乳糜微粒和极低密度脂蛋白中TG 分解的关键限速酶[16]，它们不仅是脂代谢的关键限速酶，对糖代谢也有重要作用（因为敲除ATGL 或LPL 基因的小鼠不仅出现肥胖、脂代谢紊乱，还会出现胰岛素抵抗、血糖升高）。我们前期的研究发现，4周有氧运动可能通过上调ATGL和LPL来改善OB和DM 雄性大鼠的糖、脂代谢紊乱[17]；而另一篇文献报道了有氧运动通过调节糖代谢关键蛋白GLUT4的表达与活性来改善肥胖大鼠的糖、脂代谢[18]。目前，雄激素对糖、脂代谢的调控比较明确，但AR 在其中作用的研究还较少，更不明确AR 在运动调控糖、脂代谢中的机制是否也与上述糖、脂代谢关键酶有关。因此，本研究探究雄激素/AR 在4 周有氧运动改善OB、DM、AS 大鼠血糖血脂水平、减轻疾病症状中的作用及机制，以丰富对运动防治肥胖及其相关疾病机制的认识。

1 材料与方法

1.1 实验对象

136 只6 周龄SD 雄性大鼠，体重190～210 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[合格证号：SCXK（京）2016-0066]。大鼠喂养于上海体育学院SPF级动物实验室，可自由摄食饮水，室温控制在20℃～24℃，空气相对湿度为40%～55%，明暗交替（12 h∶12 h）。本研究的实验方案得到上海体育学院动物福利伦理委员会批准（批准号：2016004）。

1.2 实验方法

1.2.1 疾病大鼠模型的建立

110 只大鼠通过8 周高脂饮食、8 周高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）或维生素D3分别建立OB、DM 和AS 大鼠，详细建模方案和筛选标准见本课题组已发表论文[17，19]。建模成功后，所有大鼠均采用普通饲料喂养。将成功建模的大鼠随机分为OB组、OB+运动组（EOB组）、AS组、AS+运动组（EAS组），每组各8 只；DM 组、DM+运动组（EDM 组），每组各10只。另26只大鼠喂以普通饲料，其中10只作为对照组（CON组）；8只大鼠进行颈部皮下包埋AR拮抗剂氟他胺（Flutamide）缓释片，作为氟他胺组（n=8）；还有8 只仅做颈部切口，作为假手术组。

1.2.2 运动干预方案

EOB、EDM 和EAS 大鼠经3天适应性跑台训练后，开始为期4周的递增负荷中等强度有氧运动。运动方案为：第1 周：速度15 m/min，持续30 min；第2 周：15 m/min，60 min；第3 周：20 m/min，60 min；第4 周：20 m/min，90 min。每周运动6 次，每次运动前后进行4～6 min的热身和整理活动，每周运动6天，每天1次。

1.2.3 大鼠体重和血液指标检测

每周测量大鼠的进食量、体重和空腹血糖水平，于最后一次运动干预结束后36 h，腹腔注射水合氯醛麻醉并处死大鼠。下腔静脉取血收集血清，迅速取出肝脏、腓肠肌和肾周脂肪组织放置于液氮中，后转入－80℃超低温冰箱保存备用。血脂四项由南京建成生物工程研究所测定；用罗氏血糖仪测得大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）；ELISA 方法检测血清睾酮（R&D公司，美国）和血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）水平（Sigma-Aldrich公司，美国）。

1.2.4 肝脏、骨骼肌和脂肪组织AR、PEPCK 蛋白水平的检测

采用Western blot 方法检测肝脏、腓肠肌和肾周脂肪组织的AR、PEPCK 蛋白水平。取适量的组织剪碎，加入700 μl 含有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液中（PMSF∶RIPA=1∶100，上海碧云天生物技术公司），机械匀浆后超声裂解组织，于4℃、12000 r/min 离心30 min 后取上清（重复两次），用增强型二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（上海碧云天生物技术公司）测定蛋白浓度。样品通过聚丙烯酰氨凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h 后加入AR（1∶500，Santa Cruz 公司，美国）或PEPCK（1∶1000，Santa Cruz公司，美国）、内参βactin（1∶1000，CST 公司，美国）或GAPDH（1∶1000，CST公司，美国）的抗体4℃孵育过夜，用1×TBST冲洗4次，每次6 min，再加入相应的二抗（1∶3000，HRP标记，CST公司，美国），常温孵育1.5 h后使用全自动化学发光图像分析系统（Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司，中国）显影分析。

1.3 统计学分析

所有实验数据均采用SPSS 20.0 统计学软件进行处理，结果以均值± 标准差（±s）表示，体重和血脂采用重复测量方差分析，多组之间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异。采用Pearson 相关系数对血清睾酮水平和血糖血脂指标的相关性进行分析，并用GraphPad Prism 5生成图像。

2 结果

2.1 OB、DM和AS大鼠模型的成功建立

OB大鼠的体重是对照组大鼠平均体重的1.2倍以上（647 ± 35.68 g vs.523 ± 33.89 g），与CON 组大鼠比较，DM 大鼠FBG（15.50 ± 3.76 mmol/L vs.5.56± 0.46 mmol/L）和FINS（22.60 ± 4.74 μIU/ml vs.8.85 ± 1.77 μIU/ml）水平显著升高，且出现“三多一少”的典型糖尿病症状；不同于CON组大鼠，AS大鼠主动脉血管壁增厚和平滑肌细胞增生，并出现红色粥样斑块（见本课题组已发表论文[19]），以上结果表明成功建立了OB、DM和AS大鼠模型。

2.2 运动干预期间各组大鼠的摄食量

4 周运动干预期间各组大鼠的摄食量如表1 所示，OB与EOB、DM与EDM以及AS与EAS组的摄食量均无显著差异。

表1 4周有氧运动干预期间各组大鼠摄食量（g）

2.3 有氧运动改善大鼠的血糖血脂水平，减轻疾病症状

OB、DM 和AS 组大鼠均出现不同程度的血糖（图1A）和血脂（图1B）紊乱。与CON组比较，OB、DM和AS组大鼠的胰岛素抵抗和FINS 水平均显著增加（P＜0.05），以DM 组最为明显，且DM 组的FBG 也显著升高（P＜0.01）；此外，与CON 组比较，三种疾病大鼠的血清TC、TG和LDL水平均显著升高（P＜0.05），DM大鼠还出现HDL水平显著下降（P＜0.05），但OB、AS组的HDL无显著变化。有氧运动显著改善甚至逆转OB、DM 和AS大鼠的上述异常指标，包括降低EOB 组的TG、LDL、FINS和胰岛素抵抗水平（P＜0.05），EAS组的LDL水平（P＜0.05），以及EDM 组的FBG、FINS 和胰岛素抵抗水平（P＜0.01），TC、TG、LDL水平（P＜0.05）。

由图2 可知，除了改善血糖血脂水平，4 周有氧运动还显著减轻了疾病症状，包括降低OB 大鼠的体重（EOB 大鼠的体重下降到CON 大鼠的平均水平，从641.88 ± 34.77 g 降低到593.25 ± 39.93 g），改善DM大鼠的FBG（图2A）、“三多一少”症状[如体重不再下降、饮食摄入量减少（图2B）]和AS 大鼠的主动脉病损（见本课题组已发表论文[19]）。

2.4 有氧运动调控大鼠血清睾酮水平，以及睾酮与血糖血脂水平的相关性

如表2 所示，与CON 组比较，OB、DM 和AS 组大鼠血清睾酮水平均显著下降（P＜0.05），但睾酮的降低程度在这三种疾病大鼠模型之间没有显著差异。与各自疾病组比较，EOB 和EAS 组大鼠血清睾酮水平显著升高（P＜0.05），但EDM大鼠血清睾酮水平无显著变化。

图1 4周有氧运动后各组大鼠血糖血脂水平比较

图2 4周有氧运动后各组大鼠体重、FBG和进食量的变化

表2 4周有氧运动后各组大鼠血清睾酮水平比较

在大鼠血糖血脂指标与血清睾酮水平相关性分析中，血清睾酮水平与血清LDL（r=－0.413，P=0.015，图3B）、TG 水平呈显著负相关（r=－0.356，P=0.039，图3C），但未见睾酮水平与FBG、HOMA-IR和TC、HDL的显著相关性（图3A、3D～3F）。

图3 大鼠血清睾酮水平和血糖血脂指标的相关性分析

此外，本研究还分析了睾酮水平极大值和极小值（极值不同于异常值，它的判断标准是虽偏离均值但仍在均值的3 倍标准差范围之内）的OB、EAS 和EDM 组大鼠的血糖血脂水平，结果在3 组大鼠中均发现低睾酮水平大鼠的血脂均高于该组血脂均值，高睾酮水平的血脂低于该组血脂均值；仅在EDM 组发现高、低睾酮水平间有FBG 的差异，而OB、EAS 组的FBG 无差异（表3），提示血清睾酮水平可能主要受血脂水平的影响。

表3 血清睾酮水平极值大鼠的血糖血脂水平比较

2.5 有氧运动对大鼠肝脏、腓肠肌和脂肪的AR蛋白水平的影响

如图4 所示，与CON 组大鼠比较，OB 组大鼠的肝脏（图4A）和腓肠肌（图4D）、DM组大鼠的肝脏（图4B）以及AS组大鼠的腓肠肌（图4F）均出现AR蛋白水平的降低（均P＜0.05），而OB（图4G）和AS（图4H）组大鼠的脂肪（DM大鼠没有肾周脂肪）未发现AR蛋白水平的改变。与各自对应的疾病大鼠比较，EOB 大鼠腓肠肌和肾周脂肪（P＜0.05，P＜0.01）、EDM 大鼠的肝脏（P＜0.05），以及EAS大鼠肝脏和腓肠肌（P＜0.01，P＜0.05）的AR 蛋白水平显著增加，但EAS 大鼠肾周脂肪AR 蛋白水平却显著降低（P＜0.05）。

2.6 AR拮抗剂氟他胺对正常大鼠血糖血脂、血清胰岛素和睾酮水平的影响

为证实AR对正常大鼠血糖血脂水平的影响，本研究在普通大鼠的颈部皮下包埋AR 拮抗剂氟他胺缓释片（60天缓释）以抑制AR的作用。结果如图5所示，与假手术（Sham）组大鼠比较，氟他胺包埋组大鼠TC、TG和LDL 水平显著升高（P＜0.05）（图5A），而FINS、FBG（图5B）和血清睾酮水平（图5C）无显著差异。

2.7 有氧运动对各组大鼠肝脏和腓肠肌PEPCK 蛋白水平的影响

如图6 所示，与CON 组大鼠比较，DM 组大鼠肝脏（图6B）和腓肠肌（图6E）、OB 大鼠腓肠肌（图6D）PEPCK蛋白水平都显著增加（P＜0.05），未发现AS大鼠的PEPCK有变化（图6C、F）；与各自对应的疾病大鼠比较，EOB、EDM大鼠的肝脏和腓肠肌以及EAS大鼠肝脏（图6C）的PEPCK都显著下降（P＜0.05）。

3 讨论

雄激素/AR 水平低下与OB、DM 和AS 等慢性疾病的发生发展紧密相关，互为因果[4]。一方面，雄激素/AR低下导致糖、脂代谢紊乱，肥胖及肥胖相关疾病发生率增加等，例如雄激素/AR受抑制的雄性小鼠出现血脂异常和胰岛素抵抗[5]，性腺机能减退的男性出现较高的体脂率、肥胖相关疾病患病风险升高；另一方面，肥胖及肥胖相关疾病的男性或雄性动物，其雄激素/AR水平降低，如在男性OB 和DM 患者中发现雄激素水平显著下降[20]。雄激素水平低下现象在雄性OB、DM 和AS 大鼠中也较常见。本研究有类似发现，即雄性OB、DM 和AS 大鼠均出现了显著下降的血清睾酮水平和血糖血脂紊乱。血清睾酮的降低程度在这三种疾病模型大鼠之间没有显著差异，尽管DM 大鼠血糖出现异常，而其他两组的血糖正常，这似乎与以往研究报道的雄激素水平降低幅度受糖、脂代谢紊乱程度影响[21]不一致。本研究对血清睾酮水平和血糖血脂指标进行相关性分析时，仅发现血清睾酮水平与TG、LDL 水平呈显著负相关，而与空腹血糖无关。OB、EDM 和EAS 各组雄激素水平极值大鼠的血糖血脂水平与该组血糖血脂平均水平的比较结果（雄激素水平极小值大鼠的TC、TG 和LDL 水平均高于该组TC、TG 和LDL 平均水平）也提示血清睾酮水平可能主要受血脂水平影响。而本研究的OB、DM 和AS三组大鼠的脂代谢紊乱程度没有显著差异，这可能是雄激素下降幅度在三组之间无差异的原因。

图5 AR拮抗剂氟他胺对正常大鼠血糖血脂、血清胰岛素和睾酮水平的影响

图4 4周有氧运动后各组大鼠肝脏、腓肠肌和脂肪的AR蛋白水平比较

图6 4周有氧运动后各组大鼠肝脏和腓肠肌PEPCK蛋白水平比较

不仅雄激素水平下降与血糖血脂异常有关，AR的功能受到抑制也可诱导男性或雄性动物血糖血脂紊乱的发生。本研究在正常大鼠的颈部包埋了AR 拮抗剂氟他胺缓释片以抑制AR的作用。结果发现，相对于假手术组，包埋组大鼠出现脂代谢异常，即TC、TG和LDL水平异常升高，证实了AR在维持大鼠血脂稳定中的重要作用。综上，雄激素/AR 水平降低可能是OB、DM 和AS雄性大鼠血糖血脂异常的原因之一。

规律的有氧运动在维持机体糖、脂代谢稳态中所发挥的重要作用已有报道[18，22，23]，但其作用机制仍未被阐明。雄激素及AR 水平受到运动的调控[24-26]，尽管大量研究已证实雄激素/AR 在运动促进骨骼肌质量和力量增加中发挥了重要作用[26-28]，但关于其在运动调控糖、脂代谢中的作用还处于初步研究阶段。本研究发现，4周有氧运动不仅改善了OB、DM和AS大鼠的血糖血脂水平，还减轻了疾病症状[包括OB 大鼠体重显著降低、DM 大鼠空腹血糖水平下降、“三多一少”症状的减轻（如体重不再下降和摄食量减少），以及AS大鼠主动脉病损减轻等]（见本课题组前期发表的论文[17，19]）。与此同时，4周有氧运动显著升高OB和AS大鼠的血清睾酮水平，增加肝脏、腓肠肌的AR 蛋白水平。但不同于OB和AS大鼠，有氧运动并没有显著升高DM大鼠的睾酮水平，且仅显著增加DM 大鼠的肝脏AR 蛋白水平，对腓肠肌AR蛋白水平无明显影响。分析其原因可能与以下2 个因素有关：（1）DM 大鼠糖、脂代谢紊乱更为严重，4 周有氧运动尽管改善了血糖血脂，但大多数仍为异常值，可能还不足以引起血清雄激素和腓肠肌AR蛋白水平的显著变化。（2）在调控糖、脂代谢中，可能肝脏比腓肠肌的作用更敏感和更重要，不是特别强烈的相同运动刺激可能仅引起肝脏AR 蛋白水平的增加。以上结果提示雄激素/AR在运动改善OB、DM和AS雄性大鼠血糖血脂中发挥作用。

在细胞水平，AR和过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）有相互调控作用。一方面，AR能调控PPARγ的表达和活性，如补充AR激动剂双氢睾酮可显著降低前列腺癌细胞的PPARγ蛋白水平，而AR拮抗剂阻断了上述作用[29]。另一方面，PPARγ也可调节AR的表达与活性[30]，且PPARγ拮抗剂GW9662 显著降低前列腺癌细胞的AR活性和表达[31]。

PPARγ在维持血糖和血脂稳定中发挥很重要的作用，已被确定为治疗肥胖和糖尿病的靶分子。PPARγ调控糖、脂代谢的作用是通过调控其靶基因——糖、脂代谢关键酶ATGL、LPL 和PEPCK 等实现的[12-14]。运动改善骨骼肌的葡萄糖运输和脂肪酸氧化[32]，减少肝脏内脂肪的含量[33]等作用，至少部分是通过促进PPARγ的表达实现的；且运动激活PPARγ后，能增加循环和骨骼肌的ATGL[34]和LPL[16]水平。我们前期的研究发现，在OB 和DM 雄性大鼠中，运动对ATGL 和LPL 的调控也是通过上调PPARγ的蛋白表达水平来实现的[17]。本研究发现PPARγ的另一靶基因PEPCK 的蛋白水平在OB 和DM 雄性大鼠（雄激素/AR 受抑制）的肝脏、腓肠肌中异常升高，而4 周有氧运动逆转了PEPCK 水平的增加。对于AS 大鼠（雄激素/AR 也受到抑制），有氧运动也降低其肝脏PEPCK蛋白水平，尽管没有发现AS大鼠肝脏和腓肠肌PEPCK 蛋白水平的变化。PEPCK 不仅能被PPARγ调控，Pal 等[13]的研究发现，PEPCK 还能被外源补充雄激素下调，从而改善2 型糖尿病小鼠的糖代谢。因此，以上结果提示，雄激素/AR 在运动改善OB、DM 和AS 雄性大鼠血糖血脂中的作用，可能与其调控PEPCK 的蛋白水平有关，且该作用有可能通过PPARγ介导。

肝脏、骨骼肌和脂肪作为机体主要的代谢器官或组织，在糖、脂代谢紊乱相关疾病的发生发展过程中发挥了重要作用。AR在肝脏、骨骼肌和脂肪组织中均有表达，且参与对机体代谢的调节过程。而以往的研究常仅关注于AR在某一个组织中的变化，本研究同时检测了这3个组织中的AR蛋白水平，发现肝脏和脂肪组织的AR水平变化最为明显，其原因可能是肝脏和脂肪组织对有氧运动改善大鼠糖、脂代谢，减轻疾病症状的作用更敏感。值得注意的是，本研究发现运动下调（而不是上调）AS大鼠脂肪组织的AR蛋白水平，其具体原因有待进一步研究。

此外，本研究运动干预期间采用普通饲料的原因，一是前期高脂饲料喂养仅是为了建立OB、DM和AS的模型大鼠，二是保证DM 大鼠的存活率（因为预实验显示继续高脂饲料喂养，其死亡率较高）。为明确运动对疾病大鼠血糖血脂的改善作用确实来自运动，而非饮食因素，本研究检测了所有大鼠在运动干预期间的摄食量，发现与其对应的疾病组比较，EOB、EDM 和EAS大鼠的摄食量没有显著差异，表明OB、DM 和AS 大鼠的疾病症状和血糖血脂异常的改善确实是4周有氧运动所致。