孕妇外周血中游离胎儿DNA浓度与不良妊娠结局的关系

白小艺，冯俏丽，韩振艳，侯红瑛

（中山大学附属第三医院产科，广东广州 510630）

1997 年，Lo 等［1］通过实时荧光PCR 发现在妊娠妇女血浆中存在游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）。从此，以cffDNA为基础的无创产前检测（noninvasive prenatal test，NIPT）在全球范围内被快速应用于临床。cffDNA 主要来源于胎盘滋养层细胞的凋亡/坏死。在妊娠过程中，只有当胎盘组织存在，我们才能在母体血浆中测到cffDNA的存在［2］。游离胎儿DNA 浓度（fetal fraction，FF）是指来源于胎儿的cffDNA在母体血浆的游离DNA中所占的比例。当胎盘形成发育（增殖、迁移、侵袭和分化）过程中出现问题，胎盘的细胞组成、调节分子的产生及细胞转换发生变化，这些都有可能直接影响进入母体循环的胎盘滋养层细胞的类型和水平［3-4］，从而影响cffDNA 的释放和母体的炎症反应，导致FF 的变化。FF 可能作为反映胎盘功能及病变的潜在指标。本研究拟探讨FF 与不良妊娠结局的关系，以期发现FF 对预测妊娠并发症的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2017 年1 月至2018 年10 月在中山大学附属第三医院产科行无创产前检测并住院分娩的中国籍孕妇作为研究对象。纳入标准：①单胎妊娠；②我院行无创产前检测并住院分娩；③采血孕周为12+0～26+6周。排除标准：①流产、引产的孕产妇；②临床信息不完整；③胎儿存在染色体异常或接受宫内治疗者；④行体外受精-胚胎移植孕妇。

根据上述标准共纳入1 231 例并对其进行回顾性分析，其中妊娠期高血压病组（HDP 组）、胎儿生长受限（FGR）组及早产组分别为84 例、57 例和59 例，作为病例组；将无妊娠并发症的孕妇作为对照组1 031 例。收集入选孕妇的完整临床资料，包括孕妇年龄、采血孕周、体质量指数（BMI）等。所有患者签署知情同意书。本研究获本院伦理委员会批准免除申报。

1.2 实验方法

入选孕妇留取10 mL 全血标本，24 h 内进行血浆分离，采用金麦格血浆游离DNA 提取试剂盒（GenMagBio，中国），按照商品说明进行操作，从血浆中提取DNA 片段。每个血浆样品采用Ion Plus Fragment Library Kit（Life Technologies，美国），按照使用指引构建测序文库，采用Qubit2.0（Life Technologies，美国）和2100 Bioanalyzer（Aglient Technologies，美国）分别进行DNA 初步浓度和片段大小检测。将文库样本稀释到100 pmol/L，取等量混合在一起，制备测序微球，采用Proton 测序仪（Life Technologies，美国）进行上机测序。根据测序数据中DNA 片段的分布情况，分别确定出主要分属于胎儿大致序列长度分布（Cbp～Dbp）和母体本身的大致序列长度分布（Ebp～Fbp），确定胎儿序列片段的占比，及游离胎儿DNA 浓度：

1.3 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 20 软件进行数据的统计分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差（），不符合正态分布的以M（P25～P75）描述。将正常孕妇中的游离胎儿DNA 浓度与年龄、孕周及BMI 进行Spearman 秩相关分析。病例组与对照组的基本资料分析采用Kruskal-WallisH检验，差异有统计学意义时采用Bonferroni 法进行病例组与对照组两两比较。对照组与病例组的FF差异采用无序多分类logistic 回归。以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常孕妇的采血孕周与FF 的分布情况

行NIPT的1 031例正常孕妇中，外周血的游离胎儿DNA 浓度范围为（5.05～35.39）%，均值±标准差为（12.03±3.64）%；采血孕周范围12+0～26+6周，采血孕周92%（946/1 031 例）集中在13+0～21+6周，FF 在总体上趋于平稳（图1）。

2.2 正常孕妇的FF 与基本资料的相关性

行NIPT 的1 031 例正常孕妇中，将游离胎儿DNA 浓度（FF）与孕妇的年龄、采血孕周及BMI 进行Spearman 秩相关分析，结果表明，FF与孕妇BMI存在负相关（rs=-0.079，P<0.05），FF与采血孕周、孕妇年龄不存在相关关系（P>0.05；表1，图2）。

2.3 行NIPT 的对照组与病例组的基本资料比较

本研究共纳入行NIPT 的孕产妇1 231 例，其中妊娠期高血压疾病组（HDP 组）、FGR 组及早产组分别为84、57 和59 例，对照组1 031 例，对临床基本资料进行统计分析。结果显示，HDP 组的年龄、BMI大于对照组，早产组的年龄大于对照组，差异有统计学意义；FGR 组的年龄、BMI 及早产组的BMI 与对照组差异没有统计学意义，对照组与病例组的采血孕周差异没有统计学意义（表2）。

图1 行NIPT 的正常孕妇的采血孕周与FF 分布Fig.1 Distribution of fetal fraction of different gestational weeks in normal pregnancy

表1 行NIPT 的正常孕妇中FF 与基本资料的相关性Table 1 Correlation between FF and general characteristics in normal pregnancy

2.4 行NIPT 的病例组与对照组的FF 分布比较

本研究中对照组1 031 例，FF 均值为（12.03±3.64）%，HDP 组（84 例）、FGR 组（57 例）及早产组（59 例）的FF 分别为（11.21 ± 2.60）%、（12.48 ±3.92）%和（11.66±3.34）%。采用无序多分类logistic回归进行分析，结果显示，HDP 组与对照组相比，FF 的差异具有统计学意义，OR=0.926，95%CI：（0.859，0.997），P=0.043，低FF 是发生HDP 的危险因素；而FGR 组及早产组的FF 差异均无统计学意义（表3）。

图2 行NIPT 的正常孕妇中FF 与BMI 的相关性Fig.2 Correlation of FF and BMI innormal pregnancy

3 讨论

无创产前检测（NIPT）是一种快速改变产前筛查模式的新技术，随着我们在临床实践中对它的了解进一步加深，游离胎儿DNA 在产前检测中的应用逐步扩大，因此进一步探讨游离胎儿DNA 的相关影响因素及其与妊娠并发症的关系是必要的。在母体循环总的游离DNA 分子中，母体的游离DNA 分子主要来源于造血细胞，而胎儿游离DNA 分子主要来源于胎盘发育过程中的滋养层细胞凋亡释放，母体本身的因素对FF 有重要影响。

表2 行NIPT 的对照组与病例组的基本资料比较Table 2 Comparison of general characteristics between case and control groups

表3 行NIPT 的病例组与对照组的FF 的比较Table 3 Comparison of FF between case and control groups

目前NIPT 广泛应用于胎儿染色体非整倍体性的筛查，FF 的测量是其中必不可少的。对于单胎孕妇，为确保NIPT 的准确性，要求胎儿游离DNA 浓度高于4%，否则容易出现假阴性结果［5-6］。本研究中，正常孕妇外周血的游离胎儿DNA 浓度范围为（5.05～35.39）%，达到了NIPT 对FF 的要求。此外，本研究发现，FF 与孕妇BMI 存在负相关，即孕妇BMI 越大，FF 水平越低，与国内外研究结果一致［7-8］。2018 年，Rolnik 等［9］对4317 例孕妇的数据进行分析，发现FF 随孕妇的BMI 增加而下降，Krishna 等［10］也在其队列研究中得到同样的结论，特别对于BMI > 35 kg/m2的孕妇，FF 下降更为明显。这可能由于在肥胖的孕妇中，母体的游离DNA 分子除了来源于造血细胞，还有部分来源于脂肪和间质血管组织的凋亡与破坏［11］，导致母体背景的游离DNA 增多，从而使FF 下降。因此，对于肥胖症的孕妇，行NIPT 时若FF 浓度达不到要求，可通过游离胎儿DNA 的富集，提高胎儿DNA浓度，减少母体背景因素的干扰，为NIPT 的数据分析提供更可靠的基础。

妊娠妇女外周血中的游离胎儿DNA 主要来源于胎盘滋养层细胞的凋亡/坏死，而妊娠并发症症，如妊娠期高血压疾病，胎儿生长受限，早产等，虽然病理生理机制众多，但通常最终由于对胎盘形成不可逆的影响而导致临床症状的发生和发展，如胎盘炎性因子的释放或胎盘血管异常导致胎盘灌注不足等。因此国内外多个研究致力于探索游离游离胎儿DNA 浓度与妊娠并发症的相关性，探讨FF 在预测病理妊娠中的价值。

妊娠期高血压疾病，是妊娠与血压升高并存的一组疾病，以伴或不伴蛋白尿、器官系统损害为特征的妊娠特有疾病，严重影响母婴健康，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因。疾病的确切的病理机制尚不明确，目前倾向于滋养层细胞分化受损导致“胎盘浅着床”和子宫螺旋动脉重铸不足有关。近年来联合多个生物学指标及超声指标对其进行筛查及预测的研究成为热点［12］。目前多项研究对患妊娠期高血压疾病，特别是子痫前期孕妇的cffDNA 的水平进行检测，试图了解其在疾病发展中的关系。研究发现在子痫前期的孕妇中，cffDNA 的水平比正常孕妇升高2～10 倍［13-14］，更重要的是，cffDNA 水平在疾病的临床症状发生前就已有所增加。Levine 等［15］在一项由120 位患PE 的孕妇及120 位正常孕妇作为对照组成的大型研究中，发现患PE 的孕妇血浆中的cffDNA 水平呈双相升高模式，在孕17～28 周及临床症状出现前3 周cffDNA 水平升高明显。这种结果被认为可能是胎盘形成异常导致cffDNA 释放增加及母体终末器官受损，母体肝肾脏器对于cffDNA 清除减少的组合效应。但是，cffDNA 绝对值水平不等同于游离胎儿DNA 浓度（FF）。FF 在妊娠期高血压病，特别是子痫前期妊娠人群中相对于正常孕妇明显下降。Suzumori 及其团队在纳入5 582 例孕妇的病例对照队列研究中发现，早孕期FF 较低的孕妇随后发生妊娠期高血压病的风险更高［16］，随后Rolnik 等［17］也在他们的研究中证明对于早发型子痫前期患者，总的游离胎儿DNA 水平升高，而FF下降。本研究中，HDP 组的FF 相较于对照组降低，低FF 是HDP 发生的危险因素，与Suzumori 及Rolnik 等的研究结果一致。cffDNA 的绝对值升高而FF 降低，这个矛盾性的结果可以从三个方面进行解释：①HDP 的孕妇胎盘体积小，一项近期的研究显示发展为HDP 的孕妇早孕期的胎盘体积多比正常孕妇小［18］；②BMI 较大的妊娠妇女循环中母体脂肪细胞凋亡释放的游离DNA 较正常妊娠孕妇多；③母体全身炎症因子激活增加。正常妊娠孕妇母体来源的游离DNA 分子主要来自于造血系统，而在妊娠期高血压病孕妇中，母体的全身炎症反应增强［19］，血管内皮细胞损伤及终末器官受损均可引起母体来源的游离DNA 分子增多。

胎儿生长受限（FGR）是由多种不同病因发展而成的复杂性妊娠合并症，其中胎盘功能不全是主要病因之一。目前FGR 尚缺乏有效的预防干预措施，国内外逐步开展早中孕期联合生物学指标及超声指标对FGR 进行预测及筛查的相关研究，但该类筛查模型灵敏度低，假阳性率高，仍需更进一步的研究建立更优化的筛查及预测模型。关于cffDNA 水平与FGR 发病的相关研究较少。2003 年，Sekizawa 等［20］通过小样本研究（FGR 组9例，对照组20 例）发现cffDNA 的量在两组间水平相近，无明显差异。随后，Smid 及其同事［21］证明cffDNA 水平在患FGR 的孕妇血浆中有所升高。此结果也在后续研究中得到验证［22］，考虑胎盘功能障碍导致cffDNA 释放增多占据其中部分原因，也有研究表示在FGR 患者中，由于胎儿缺氧刺激胎儿循环中促红细胞生成素的产生，使循环胎儿有核红细胞的数量增加，凋亡或裂解后释放更多的cffDNA［23］。关于FF 与FGR 的关联性，Rolnik等［24］在其大样本研究中发现，FGR 高风险孕妇在早孕期的FF 较正常对照组偏低；Morano 等［25］也证实在早发型FGR 孕妇组中FF 下降，而在晚发型FGR组中FF与正常对照组无明显差异。本研究的FGR 组的FF 与对照组相比无明显差异，与Rafaeli等［26］的研究结果相一致。FGR 孕妇相对于正常孕妇来说，母体外周血白细胞活化增强，但低于PE患者，进一步支持PE 为全身性的母体炎症反应，而FGR 患者通常仅轻度激活炎症系统［26］。因此，母源性的游离DNA 分子及胎儿来源的游离DNA分子的升高水平相近，从而使FF 在FGR 孕妇中的变化不明显。

早产是指妊娠满28 周但不足37 周的分娩，由多因素病因共同引起子宫收缩导致宫颈进行性改变，是围产儿及婴幼儿死亡及病残的重要原因之一，早产的预测在提高早产儿生存率、降低家庭及社会负担方面具有重要意义。关于cffDNA与早产相关性的研究也受到广泛关注，但结论具有争议性。Hoesli 等［27］在47 例孕产妇的病例对照研究中发现cffDNA 水平在早产组及对照组中并无差异。而Farina 等［28］发现在自发性早产中的孕妇血浆中cffDNA 水平升高。Illanes［29］则认为cffDNA 水平在孕20～24 周的妊娠人群中未因早产的发生而与正常孕妇有所差异，不能预测宫颈缩短导致的早产。cffDNA 的释放来自临产前胎盘屏障的破坏，是临产启动的结果，难以作为预测指标。2016 年美国一项回顾性队列研究对10～20 周非整倍体高风险的单胎孕妇进行cffDNA 检测，发现早孕组FF 的升高与早产率并无关联，而中孕组FF 升高与早产发生率显著相关［30］，表明cffDNA 的增加与早产之间可能存在相关性，但仍需要进一步的研究来了解cffDNA 的具体定量，并根据不同孕周建立一个正常范围。本研究中，早产组的FF 与对照组相比无明显差异，与Quezada 等［31］的研究结果相一致。早产的发生发展受众多因素共同影响，胎盘病变可能并不占据主导作用，故cffD⁃NA 浓度在早产的孕妇中变化不显著，尚需进一步分析研究。

综上，本研究发现患妊娠期高血压疾病的孕妇血浆中游离胎儿DNA 的浓度降低，低FF 是HDP 发生的危险因素，尚未发现FF 与胎儿生长受限、早产的发病有关，但本研究的病例组数目仍较小，可继续扩大样本量进一步研究。