miR-29a对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及其机制研究

刘 鹏，白意晓

(阆中市人民医院胃肠外科，四川 阆中 637400)

胃癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其发病率居于我国恶性肿瘤的首位，死亡率分别居于我国城市和农村恶性肿瘤的第2位和第1位[1]。目前胃癌的治疗以手术、放化疗等综合治疗手段为主，多数患者就诊时已进入中晚期，治疗效果并不满意[2]。因此，了解胃癌的发病机制，寻找有效的生物标记物或基因治疗靶点，对于胃癌的诊疗有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)在细胞周期、分化、发育等多种生物学进程中有重要作用，成为近年来肿瘤治疗靶点研究的热点[3]。miR-29a 作为miRNA 家族成员已被证实在胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中呈低表达或不表达，并参与肿瘤的发生、发展、侵袭与转移[4-5]。前期研究中通过检测胃癌根治术后患者胃癌组织及癌旁组织miR-29a 的表达情况，发现miR-29a 在胃癌组织中表达下调，提示miR-29a 的表达下调可能参与胃癌的发生发展。信号转导子与转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)在信号转导和转录激活中发挥关键性作用，在包括胃癌的许多实体瘤中发现其蛋白的组成型激活具有普遍的促炎致癌特征[6]。故此，本研究探讨miR-29a 对人胃癌细胞增殖、迁移的影响及对STAT3的作用，初步解释其调控机制，以期为今后胃癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

0.25%胰蛋白酶、RPMI 1640 培养液，均购于武汉普诺赛生命科技有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于济南源茂化工有限公司；Trizol RNA 抽提试剂、 荧光素酶检测试剂盒、LipofectamineTM3000 阳离子脂质体购于美国Invitrogen公司；siRNA 片段购于上海基屹生物科技有限公司；化学发光检测试剂盒(electrochemiluminescence，ECL)购于北京庄盟国际生物基因科技公司；蛋白定量BCA试剂盒购于美国Pierce 公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HER)标记的山羊抗兔IgG 抗体，兔抗鼠IgG 抗体购于美国Santa Cruz 公司；STAT3、 磷 酸 化STAT3(phosphorylated-STAT3， p-STAT3)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、U6 抗体、βactin 抗体购于美国Sigma 公司。Mx 3005P 荧光定量PCR仪购于美国Agilent公司，GelDoc-It 310凝胶成像系统购于美国UVP公司，-80 ℃低温冰箱购于济南卓隆生物科技有限公司，Tecan-5082 Sunrise 全自动酶标仪购于奥地利TECAN公司，徕卡生物倒置显微镜购于德国Leica公司。

1.2 细胞培养

人胃癌SGC-7901 细胞株，购于上海生命科学院细胞所，采用含10%胎牛血清、青/链双抗的RPMI 1640 培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的密闭式孵箱内培养。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染和分组Has-miR-29a 模拟物(mimics)根据miR-29a成熟体序列(miRBase数据库检索序列信息)合成，正义链5′-AUUGCGUAGAGAUUCA AGCUCUG-3′；反义链5′-ACUAGGUUAACGAUCGG UAGCUA-3′，阴性对照siRNA为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照，以上由上海吉玛公司合成。依据转染试剂LipofectamineTM3000 说明书步骤进行细胞转染，转染前24 h 取对数生长期人胃癌SGC-7901细胞按1.0×105个/孔接种于6孔板，使细胞转染时底面覆盖率达50%～70%。125 μL 无血清抗生素的RPMI 1640 培养液稀释9 μL miRNA mimics 及对照质粒，EP 管中加入5 μL LipofectamineTM3000，轻柔吹吸数次混匀，室温静置5 min。吸去培养液，每孔依次加入500 μL 无抗生素含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养液，后加入上述转染物，混匀，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，转染6 h 后更换新鲜RPMI 1640 培养基继续培养。miR-29a 过表达实验分为miR-29a转染组、质粒对照组、空白对照组，miR-29a 转染组转染has-miR-29a mimics 质粒，质粒对照组转染siRNA对照质粒，未经处理的人胃癌SGC-7901细胞为空白对照组。STAT3 下调实验分为空白对照组和STAT3 抑制组，STAT3 抑制组细胞在底面覆盖率达50%～70%时加入STAT3 抑制剂溶液12.25 μL，空白对照组为未经处理的人胃癌SGC-7901 细胞。以上实验每组均设2个复孔，独立重复3次。

1.3.2 qPCR 检测人胃癌SGC-7901 细胞miR-29a、VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 表达取miR-29a转染及STAT3抑制剂处理48 h后细胞，Trizol法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，以U6及β-actin为内参，进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测目的基因，扩增引物序列由上海生工合成，序列如下：miR-29a，上游5′-ATGCACCTT CGAGCATTGT-3′，下 游5′-TGTGCGTGTCTATATAC GA-3′；VEGF，上游5′-ATGCTTCTGAAGTTGGGAT CT-3′，下游5′-TAGCATCGATCTATGATAGTCA-3′；STAT3，上游5′-TCTCTGACTAGGCTGAGTGATT-3′，下 游5′-CTATACTCAGATACTTGCGCTA-3′；cyclin D1，上游5′-AGTGGATTAAGTGGAGTGAGC-3′，下游5′-ACTGATACAAGTTGATCCGATG-3′；U6，上游5′-GTGCGTCTACGGTTCTGGA-3′，下游5′-CTGCAT GATAGCGACGATTC-3′；β-actin，上游5′-AGGTGA CTGTGCTAGAGTG-3′，下游5′-TAAGTTATGGAGAT GGACGA-3′。严格按照试剂盒说明书进行qPCR 分析，反应采用20 μL 体系：2×浓缩的qPCR 扩增预混合溶液10 μL，10 mol/L 上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，双蒸馏水 7 μL 混匀；反应条件：预变性94 ℃、20 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃延伸3 min，使用2-ΔΔCT法表示目的mRNA的相对表达水平。

1.3.3 Western blot 检 测 及VEGF、STAT3、p-STAT3、cyclin D1 蛋白表达情况取miR-29a 转染及STAT3抑制剂处理48 h后细胞，经SDS裂解液裂解后提取总蛋白，BCA试剂盒测定其蛋白浓度，常规行SDS-PAGE 电泳后转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，经TBST 洗涤液洗涤后，分别加入VEGF、βactin 抗体(1∶1 000 稀释)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶8 000 稀释)，ECL 试剂盒显色，以ImageJ 软件对条带灰度值进行分析，以目的蛋白与内参β-actin灰度值比值为相对表达水平。

1.3.4 MTT实验检测细胞增殖情况取miR-29a转染及STAT3抑制剂处理48 h后细胞，胰蛋白酶消化后接种于96 孔板，2.0×103个/孔，每组6 个复孔，在培养24、48、72 h 时每孔分别加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h 后弃培养液，加入DMSO 溶液150 μL，轻柔吹吸使其充分溶解，以酶标仪检测各孔490 nm波长处的光密度D(490)值。

细胞相对增殖率=D(490)实验组/D(490)空白对照组×100%

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移情况取miR-29a转染及STAT3 抑制剂处理48 h 后对数生长期人胃癌SGC-7901 细胞，接种于96 孔板，2.0×103个/孔，细胞长满单层后，弃去培养基，使用移液枪头在培养板底部划一直线，PBS 轻柔吹洗，保持边缘整齐，每孔依次加入DMEM 培养液(不含胎牛血清)，划痕后即刻(0 h)及24 h在倒置显微镜下观察细胞的迁移情况，测量划痕宽度(l)。

迁移率=(l0h-l24h)/l0h×100%

1.4 统计学分析

采用SPSS 24.0 统计软件分析处理数据，以xˉ±s表示计量资料，空白对照组、质粒对照组、miR-29a转染组的mRNA、蛋白表达、细胞相对增殖率及迁移率的比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用t检验LSD 法。空白对照组与STAT3 抑制组的mRNA、蛋白表达、细胞相对增殖率及增殖率比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-29a、VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA表达情况比较

qPCR 实验结果见表1。miR-29a 转染后，空白对照组、质粒对照组、miR-29a 转染组的STAT3 mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组、质粒对照组比较，miR-29a 转染组细胞的miR-29a 相对表达水平升高，VEGF、cyclin D1 mRNA 相对表达水平下降，差异均有统计学意义(P＜0.01)；空白对照组细胞的miR-29a、VEGF 及cyclin D1 mRNA 相对表达水平与质粒对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 miR-29a，VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 相对表达水平比较(n=3，s)

表1 miR-29a，VEGF、STAT3、cyclin D1 mRNA 相对表达水平比较(n=3，s)

与空白对照组比较，*P＜0.01；与质粒对照组比较，#P＜0.01.

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2.2 VEGF、STAT3、cyclin D1蛋白表达情况比较

Western blot 实验结果见图1 和表2。miR-29a 转染后，与空白对照组、质粒对照组比较，miR-29a 转染组细胞的VEGF、cyclin D1 蛋白相对表达水平及p-STAT3/STAT3 下降，差异均有统计学意义(P＜0.01)；空白对照组与质粒对照组细胞的VEGF、cyclin D1 蛋白相对表达水平及p-STAT3/STAT3比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 MTT实验结果

MTT 实验的结果见表3。miR-29a 转染后，空白对照组、质粒对照组与miR-29a 转染组转染后24、48、72 h的细胞相对增殖率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a转染组转染24、48、72 h的细胞相对增殖率更低，差异有统计学意义(P＜0.01)；空白对照组与质粒对照组转染24、48、72 h的细胞相对增殖率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 Western blot检测结果

表2 VEGF、STAT3、cyclin D1蛋白表达水平比较(n=3，x±s)

表3 各组人胃癌SGC-7901细胞增殖情况比较(n=3，s，%)

表3 各组人胃癌SGC-7901细胞增殖情况比较(n=3，s，%)

空白对照组比较，*P＜0.01；与质粒对照组比较，#P＜0.01.

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2.4 细胞的迁移率比较

划痕实验的结果见图2。miR-29a转染后，空白对照组、质粒对照组、miR-29a 转染组的细胞迁移率分别为(65.32±12.33)%、(67.20±11.58)%、(28.59±8.52)%，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a 转染组的细胞迁移率更低(均为P＜0.01)，空白对照组与质粒对照组细胞迁移率比较，差异无统计学意义(t=0.779，P=0.438)。

图2 细胞迁移划痕实验结果

2.5 STAT3 下调对STAT3、cyclin D1 mRNA 及蛋白表达的影响

Western blot 和qPCR 实 验 结 果 见 图3 和 表4。STAT3 抑制剂处理细胞后，与空白对照组比较，STAT3 抑制组细胞cyclin D1 mRNA 及蛋白相对表达水平、p-STAT3/STAT3 下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，空白对照组与STAT3抑制组细胞STAT3 mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图3 Western blot检测结果

表4 STAT3下调对STAT3、cyclin D1 mRNA及蛋白表达的影响(n=3，s)

表4 STAT3下调对STAT3、cyclin D1 mRNA及蛋白表达的影响(n=3，s)

与空白对照组比较，*P＜0.01.

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2.6 STAT3 下调对人胃癌SGC-7901 细胞增殖的影响

MTT 实验的结果见表5。STAT3 抑制剂处理细胞后，与空白对照组比较，STAT3抑制组24、48、72 h的细胞相对增殖率均更低，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表5 STAT3下调对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响(n=3，，%)

表5 STAT3下调对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响(n=3，，%)

与空白对照组比较，*P＜0.01.

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2.7 STAT3 下调对人胃癌SGC-7901 细胞迁移的影响

划痕实验的结果见图4。STAT3 抑制剂处理细胞后，STAT3 抑制组的细胞迁移率为(33.52±7.80)%，低于空白对照组的(60.52±10.05)%，差异有统计学意义(t=5.199，P＜0.01)。

3 讨 论

胃癌的发病原因与遗传、环境、饮食、幽门螺杆菌感染等多因素密切相关，其具体发病机制仍未明确[7]。发病早期无典型症状，容易被忽视，早期诊断率较低。晚期有并发症及转移，出现梗阻、恶心呕吐、进食困难、消化道出血、扪及包块、贫血等症状，预后较差，具有较高的死亡率。癌细胞的增殖与转移是治疗后复发的关键，也是导致患者死亡的主要原因[8]。癌细胞生长周期失衡是肿瘤增殖与转移的主要机制，这一过程涉及抑癌与致癌相关基因的突变、原癌基因的激活及细胞调节周期基因功能的改变等多种机制[9]。因此，了解相关基因的调控机制，对于寻找有效的靶向治疗药物，改善患者的预后有重要意义。

图4 细胞迁移划痕实验结果

miRNA 是具有广泛基因调控作用的小分子RNA，能够调控靶基因mRNA 转录后的表达水平，调节细胞的生长、分化、凋亡、代谢等多种生物学行为[10]。Zhang 等[11]认为，胃癌存在多种miRNA 分子的异常表达，且其增殖、凋亡等生物学行为与miRNA分子密切相关。miR-29a是miRNA 家族的重要成员，在生物体中具有抑癌作用，能解除相关靶基因表达的抑制作用，使靶基因表达失调，对细胞的生成生物学功能产生影响[12]。癌细胞的增殖、转移与新血管的生成密不可分。VEGF 是具有高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能在低氧环境下与内皮细胞膜上的VEGF 受体结合，激活有丝分裂原活化蛋白激酶，促进VEGF的有丝分裂，诱导血管细胞的增生，促进肿瘤血管和淋巴管的生成，为肿瘤细胞的生长与转移提供条件[13]。本研究结果显示，miR-29a 转染后，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a 转染组的miR-29a相对表达水平升高，VEGF mRNA 与蛋白相对表达水平均下降，说明miR-29a 可抑制VEGF mRNA 和蛋白的表达。此外MTT实验结果显示，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a 转染组转染后24、48、72 h的细胞相对增殖率降低；划痕实验中，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a 转染组的迁移率降低，提示miR-29可能通过抑制VEGF的表达影响人胃癌细胞的增殖和迁移。

细胞信号的转导与调控是肿瘤发生、发展的重要机制之一。STAT3 是肿瘤细胞重要信号调控蛋白，具有信号转导和转录双重功能，经活化后参与细胞增殖、分化、凋亡等细胞周期的调控[14]。研究[15]显示，活化的STAT3分子能对目标靶基因的表达发挥持续调控作用，促进细胞的恶性转化与肿瘤的发生。Cyclin D1 是STAT3 细胞信号传导的下游分子，能调控G1/S期过渡检查点，参与细胞周期的精准调控，维持细胞正常的生长发育，Cyclin D1基因的改变，可导致细胞周期的异常改变，促进细胞癌变[16]。研究[17]认为，CXC 受体4 能调控STST3 信号通路介导下游靶基因Cyclin D1的表达，影响细胞的生长、凋亡。刘彬等[18]证实，抑制非小细胞肺癌血管内皮生长因子受体2，旁路活化的STAT-3可直接或间接调控Cyclin D1的表达，增强放疗敏感性。本研究结果中，过表达实验中miR-29a 转染后，与空白对照组和质粒对照组比较，miR-29a转染组的p-STAT3/STAT3与cyclin D1 mRNA及蛋白表达降低；STAT3 下调实验中，应用STAT3 抑制剂后，STAT3 抑制组的cyclin D1 mRNA 及蛋白相对表达水平、p-STAT3/STAT3、不同时刻MTT 实验相对增殖率与细胞迁移率均低于空白对照组，提示miR-29a 可通过下调p-STAT3蛋白、cyclin D1 mRNA 及蛋白的表达，影响胃癌的增殖与迁移。

综上所述，miR-29a 能负调节VEGF 的表达，影响人胃癌细胞的增殖与迁移，其机制可能与抑制STAT3 蛋白磷酸化及cyclin D1 mRNA 与蛋白的表达有关。在今后的研究中，可将miR-29a 作为胃癌基因靶向治疗的参考靶标。