抗氧化剂对山羊精液冷冻保存效果的研究进展

潘 赟， 刘世荣，易晓华，张 宇，孙秀柱，2*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100;2.西北农林科技大学 草业与草原学院，陕西 杨凌 712100)

随着人工授精技术的广泛应用，精液冷冻保存研究在动物生产繁殖领域方面也受到高度重视，然而精子在冷冻保存过程中会受到不同程度的损伤，如：物理损伤，化学损伤和氧化应激损伤。其中，氧化应激损伤是降温保存过程中损害精子的主要因素，对精子结构形态会产生一系列的不利影响，包括细胞内冰晶的形成、脂质相变以及质膜重组引起的膜结构和功能的改变，造成冷冻复苏后精液品质下降，严重制约精液冷冻保存技术的发展。家畜精子对低温尤为敏感，冷冻解冻后精子活力一般不超过50%[1]。在山羊精液冷冻保存过程中，由于精子质膜中含有大量的不多饱和脂肪酸，使山羊精液在冷冻保存期间极易受到氧化应激损伤影响，活性氧的过量产生使精子细胞内抗氧化防御平衡体系遭到破坏[2]，进而造成精子质膜脂质过氧化，影响精子的运动性、代谢及细胞内成分的高渗漏率，破坏精子顶体、质膜及DNA的完整性。在实践应用中，添加外源性抗氧化剂可以减少精子细胞遭受氧化应激损伤影响，降低ROS及过氧化水平，提高精子品质及母畜授胎率。为此，本文以活性氧的产生及对精液冷冻保存损伤机理和常用抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的作用两方面进行综述，期望为山羊精液冷冻保存相关研究提供一定的理论依据和参考。

1 活性氧对山羊精液冷冻保存的影响

活性氧(Active Oxygen , ROS)是生物体内正常有氧代谢过程中产生的一系列副产物，由于核外含有不成对电子,它们能够形成高活性分子，在与电子反应时，氧转化为活性氧物质，主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH-)、一氧化氮(NO)等[3]。精子细胞内ROS的产生主要是由线粒体呼吸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH氧化酶)、脂氧合酶等酶类产生。此外，在冷冻解冻过程中受渗透压、冷休克、高度稀释等因素刺激，也会产生大量ROS。ROS在动植物体内具有双重意义，在许多重要信号反应中起关键作用[4]，但ROS也是有氧代谢的有毒副产物[5]。有研究报道，在精子细胞结构和功能成熟的生理过程中，适量ROS的产生对精子细胞的成熟，诱发精子超激活运动及精子获能发挥着积极作用[6]，此外，适量的ROS还能提高酶的活性，增强机体抗氧化能力。但ROS水平较高时，精子细胞易受氧化应激损伤影响，导致细胞自身抗氧化防御机制受到破坏，失去自我保护功能，对精子细胞的存活构成严重威胁。ROS对精子的作用模式主要有三种:①脂质过氧化，是ROS影响精子功能的主要方式。它可以将细胞膜内多不饱和脂肪酸过氧化，产生丙二醛，影响精子质膜的完整性[7]；②对线粒体 ATP 产生发生影响，ROS可以降低轴丝蛋白磷酸化，影响精子的运动能力；③诱导精子DNA损伤，碱基修饰、移码突变及染色体重排[8]，改变细胞内信号传导途径，增加细胞凋亡，导致精卵结合受损[9]。此外，ROS对胚胎发育、流产和不育也有着密切的联系[10]。

2 抗氧化剂对精液冷冻保存的影响

动物生殖组织中存在自身的氧化还原平衡体系，当受到ROS刺激时，机体内抗氧化机制会被启动，以减轻自身氧化损伤程度。有研究发现，哺乳动物的精子可以通过糖酵解、三羧酸循环结合磷酸戊糖或糖酵解结合线粒体三羧酸循环途径获得能量，使精子产生氧化还原能力[11]。但在精液冷冻保存过程中，ROS的过量产生与精子抗氧化活性之间的氧化与抗氧化平衡系统受到破坏，精子质量受到严重损害。因此，添加外源性抗氧化剂是抵抗自由基诱导氧化应激的主要防御因子[12]，通过阻止自由基链的生成和蔓延来减少氧化应激造成的损伤，以维持自身抗氧化平衡，提高冻融后精子质量。

常见的抗氧化剂主要有酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂，酶类抗氧化剂也称为天然抗氧化剂，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、辅酶Q10等。非酶类抗氧化剂也称为合成抗氧化剂，主要包括维生素类(VE、VC)、氨基酸类(半胱氨酸、谷氨酰胺)、多糖类(海带多糖、枸杞多糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等)及其他抗氧化剂(褪黑素、谷胱甘肽)。这些抗氧化剂均能中和精液中过多的ROS，降低氧化应激损伤水平，保护细胞结构，改善冷冻解冻后精子品质(见表1～2)。

表1 酶类抗氧化剂的作用及机制Table 1 Action and mechanism of enzymatic antioxidants

表2 非酶类抗氧化的分类及作用机制Table 2 Classification and mechanism of non-enzymatic antioxidants

2.1 酶类抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响

酶类抗氧化剂也称为天然抗氧化剂，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)是精浆中ROS主的清除剂, 对精子发生和维持精子的正常受精能力具有积极作用，SOD广泛存在于生物体内，是一种源于生命体的活性金属酶物质，被认为是抵抗活性氧的第一道防线，在冷冻保存中能有效减少自由基产生，保护超氧阴离子自由基对机体的损害；CAT也叫接触酶酵，可以减弱或消除H2O2对细胞的毒害作用；辅酶 Q10(Coenzyme Q10，Co Q10)属脂溶性抗氧化剂，主要存在于细胞线粒体内膜上,是氧化磷酸化反应过程中多种酶的辅酶；此外，辅酶 Q10具有增强免疫力、缓解体力疲劳、抗细胞凋亡等作用。刘超等[24]研究表明，山羊精液中GSH-Px、SOD活性与精子活力呈极显著正相关。Berlingue等[25]研究发现，在培养液中添加SOD能显著提高精子活力，同对照组相比在含有SOD组中，在3 h、6 h和9 h精子活力均得到显著提高，且母畜授精率明显高于空白组。霍敏[26]在研究绒山羊精液冷冻保护中发现，添加外源性CAT可以显著提高精子质量，当添加200 U/mL CAT时能显著提高精子质膜完整率和顶体完整率；当添加300 U/mL CAT时，能显著提高精子活率、DNA 完整率、线粒体膜电位并降低细胞内ROS水平。霍敏等[27]在绒山羊精液冷冻保存研究中发现，在冷冻稀释液中添加辅酶Q10可以提高冻融后精子质量, 其中, 添加40 μg/mL辅酶Q10效果最好。

2.2 非酶类抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响

2.2.1 维生素类抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响 维生素E(Vitamin E，VE)又名α-生育酚，属于多酚类脂溶性维生素，主要存在于细胞膜中并能与膜结构中的脂质结合，使膜脂肪酸链与ROS之间共价键断裂，保护细胞中不饱和脂肪酸免受氧化反应损伤，是机体重要的抗氧化剂。Azawi等[28]研究发现，在Tris稀释剂中添加VC或VE可以显著提高山羊精子的保存时间和质量，在添加VC或VE5 ℃保存12h后精子活率分别为54.7%和45.5%，异常精子和顶体缺陷率分别为18.8%和52.8%。Kargar等[29]研究发现，在日粮中添加VE可以提高冷冻解冻后精子的活力和质膜的完整性。施力光等[30]研究发现，在日粮中添加VE有助于提高热带地区夏季高温季节山羊精子密度、活力，降低畸形率同时还能增强精浆中抗氧化酶的活性，缓解热应激。Yue等[31]研究发现，VE可以改善睾丸细胞膜和线粒体的抗氧化能力，提高精液质量；当添加200 IU VE 时对提高精液质量具有积极作用，可以显着降低MDA水平并改善睾丸细胞中SOD、GSH-PX活性，提高质膜和线粒体的完整性。

维生素C(Vitamin C，VC)又称抗坏血酸，属于水溶性维生素，它可以与机体内的自由基发生氧化还原反应，能有效地清除机体内多余的ROS及有害自由基。陈宗明等[32]研究发现，在低温保存精液稀释液中添加 3.0 mg/mL VC可以减少低温对精子的损伤，显著提高精子活力改善精液品质。宋天增等[33]研究发现，添加2.0 mg/mL VC可以降低4 ℃保存藏西北绒山羊精液全基因组DNA甲基化异常水平, 提高藏西北绒山羊精液冷藏效果。Memon等[34]研究不同冷却速度和冷冻方法时发现，VC能够改善精液冷冻解冻后精子质量，当添加8.5 mg/mL VC能改善精子活力、膜和顶体的完整性。

2.2.2 氨基酸类抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响 半胱氨酸是一种含巯基的非必需天然氨基酸，是谷胱甘肽的重要合成物，具有抗氧化作用。研究发现，在稀释液中添加半胱氨酸能够显著提高精液品质降低精子畸形率，但对质膜完整率并没有显著影响，当添加5.0 mmol/L的半胱氨酸可以提高精液品质和精浆中抗氧化酶的活性[35]；在Tris-卵黄甘油稀释液中添加半胱氨酸能降低精子脂质过氧化水平，提高母畜妊娠率[36]。但Salvador等[37]研究表明，5 ℃保存山羊精液时，在稀释液中添加半胱氨酸并不能提高精子活力。因此，添加半胱氨酸作为冷冻精子抗氧化剂有待商榷。

谷氨酰胺是哺乳动物机体组织中最丰富的一种游离氨基酸，具有改善机体氮平衡、促进蛋白质合成，为其他氨基酸、核酸的合成提供氮源的作用。此外，谷氨酰胺还能调节细胞代谢维持细胞膜结构，参与蛋白质结构的氧化还原活性[38]。研究表明，谷氨酰胺在山羊精子冻融过程中具有低温保护作用，谷氨酰胺的最佳浓度为25 Mm[39]。石薇等[40]研究发现，在添加10 mmol/L棉子糖的稀释液中, 当添加5 mmol/L谷氨酰胺时，能显著降低冷冻解冻后精子的畸形率，提高精子顶体的完整率和活率。张少华等[41]研究发现，在稀释液中添加5.0 mmol/L的谷氨酰胺对冷冻精液品质的保护效果最好。

2.2.3 多糖类抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响 多糖类抗氧化剂是由单糖通过糖苷键连接而成的化合物，属于非渗透性保护剂具有抗氧化性。此外，在冷冻保存过程中，糖类抗氧化剂还可以作为能量物质，为线粒体氧化磷酸化提供能量，提高过氧化酶的活性。王艳华[43]在山羊精液冷冻稀释液中分别添加1.0 mg/mL 海带多糖和4.0 mg/mL枸杞多糖，能有效提高冻融后山羊精子活率、顶体完整率、质膜完整率和线粒体活性；在基础液中配伍添加海带多糖和枸杞多糖也能够有效改善冷冻解冻后山羊精子活率、顶体完整率和质膜完整率，其最佳配伍浓度为 1.0 mg/mL 海带多糖+2.0 mg/mL 枸杞多糖。孟克格日乐[44]在内蒙古白绒山羊精液冷冻稀释液研究中发现，在山羊精液冷冻稀释液里添加海藻糖能有效提高冷冻解冻后精液品质，最佳浓度为0.018 g/mL。任发等[45]研究发现，在绒山羊精液冷冻保存液中分别添加4.0 mg/mL 枸杞多糖和1.0 mg/mL 海带多糖，冷冻解冻后能提高精子内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性；与单独添加枸杞多糖或海带多糖相比，配伍添加2.0 mg/mL枸杞多糖+1.0 mg/mL海带多糖也能降低精子内ROS水平，提高精子质量。席利萌等[46]研究发现，红景天多糖对山羊精液冷冻保存具有较好的冷冻保护效果, 能明显提高山羊精液冷冻解冻后精子活率、顶体完整率及GSH水平,降低丙二醛浓度,最适浓度为16 mg/L。

2.2.4 其他抗氧化剂对山羊精液冷冻保存的影响 褪黑素(Melatonin, MLT) 是一种胺类激素，具有良好的脂溶性和水溶性，色氨酸是合成褪黑素的主要成分，具有刺激抗氧化酶(如GSH-PX和SOD)活性的作用[46]，可以穿透膜结构进入细胞器发挥其强大的抗氧化功能。霍敏等[69]研究发现，在冷冻稀释液中添加褪黑素能够显著降低绒山羊精子细胞中ROS的含量, 当在稀释液中添加0.500 mg/mL的褪黑素试验组精子活率、质膜完整率、顶体完整率(53.3%、44.6%和77.9%)均显著高于空白对照组 (47.8%、36.3%和53.2%)。Ramadan等[48]研究发现，在繁殖季节褪黑激素可以显著增加精子的运动性、射精量、血液睾丸激素浓度，而在非繁殖季节，褪黑激素能有效减少死精子百分比。

谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是细胞内主要的非蛋白硫醇化合物，可与自由基结合发挥自由基清除剂的作用。研究表明，添加GSH可以减少冷冻解冻后精子中ROS的产生，提高精子的运动性及顶体的完整性[49]；在Tris冷冻稀释液中添加5 mM的GSH可提高解冻后精子活力，降低顶体异常百分比[50]；在GSH对绵羊细管冻精质量影响中发现，在葡萄糖冷冻稀释液中添加GSH可以增加冷冻解冻后精子的活力、质膜、顶体膜及DNA的完整性,当添加1 mmol/L GSH时效果，可以显著提高冻融后精子品质，还可以在一定程度上提高体外授精卵裂率及囊胚率[51]。

3 展 望

随着生殖生物学、低温生物学和人工授精技术研究发展，抗氧化剂和精液的长期保存研究也越来越深入，对山羊遗传资源的长期保持和辅助繁殖技术都有着极为重要的意义。但由于精子细胞结构的特殊性，在冷冻保存过程中，精子细胞会产生过量的ROS，ROS携带着氧化性极强的自由基,易与精子质膜发生脂质过氧化反应，破坏细胞内抗氧化平衡体系，影响精子解冻后的品质，包括运动能力、形态结构、顶体的完整性，DNA的完整性及活率等。虽然甘油、卵黄等冷冻保护剂已广泛应用到山羊精液冷冻保护实验研究中，但在繁殖生产中任存在很大程度的限制性，如在降温过程中冰晶化的产生对精子的机械损伤和物理损伤。为维持冻融后精子结构的完整性及膜的通透性，关键蛋白结构及修饰的生物学功能，提高精子质量及优良公畜的利用率。因此，进一步探索冷冻损伤的机理、分子组成结构及外源性抗氧化剂、抗冻保护剂以及膜保护剂的研究，稀释配方、冷冻解冻程序的优化组合，为推动精液冷冻保存技术的快速发展，优质资源的保护及利用提供更多技术保障，促进山羊养殖业的发展。