基于16S rRNA高通量测序研究氨苄西林钠对SD大鼠肠道菌群结构的影响

杜海洋，杨光勇，张庚鑫，田维毅，王文佳，王 平，何光志

(贵州中医药大学 基础医学院，贵州 贵阳550025)

肠道菌群(Gut microbiota)作为肠道内的正常微生物群，不仅对肠道的生理功能起重要作用，而且对宿主的生理、代谢、免疫、消化和营养的摄取功能也至关重要[1]。肠道菌群被人们称为人体的“器官”，宿主与肠道菌群间的稳定平衡对维系人体的健康发挥着不可或缺的作用，目前已成为了人们广泛的关注的研究热点[2]。近年来，高通量测序技术的应用推进了肠道菌群的研究进程，使得肠道菌群与宿主生理病理的关联得到更加深入的研究。

抗生素(Antibiotic)的问世提高了细菌感染性疾病的治愈率，但由于其滥用不仅破坏了肠道菌群的稳态，还导致了耐药菌的产生[3]；同时也有研究表明抗生素在非感染性疾病中也有治疗价值[4]。本实验室前期研究证实，抗生素破坏菌群稳态并能够抑制有益菌的丰度[5]，但仍缺乏抗生素对肠道菌群结构的影响较为全面的认知。

借助高通量测序这项技术我们能够更加全面的分析抗生素对菌群的影响。故本文通过16S rRNA测序技术分析临床一线类抗生素氨苄西林钠对SD大鼠肠道菌群结构的影响，明确抗生素肠道菌群的作用及为合理的临床应用抗生素提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与主要试剂

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体重(200±20)g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证书：SCXK(军)2012-0011; 氨苄西林钠(批号：A6180,北京博奥拓达科技有限公司)； DNA抽提试剂盒(批号：DP328-2，天根北京生化科技有限公司)；引物合成及DNA测序委托上海百趣公司完成。

1.2 主要仪器

-80 ℃冰箱(型号：88400，美国Thermo科技有限公司)；Illumia高通量测序仪(型号：HiSeq ，美国Illumina公司)。

1.3 动物分组与给药

将40只SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为4组：空白组(M0)10只、抗生素1周(M1)10只、抗生素2周(M2)10只，抗生素3周(M3)10只。抗生素组采用氨苄西林钠进行灌胃服药，1.0 mL/次，2次/d(用药剂量由成人用量换算而来，最终浓度为0.031 g/mL)；空白组除采用生理盐水灌胃外，其他方法均与抗生素组一致。

1.4 样品采集

灌胃给药后，分别在1 d、7 d、14 d、21 d处死M0、M1、M2、M3组的10只SD大鼠。分别无菌操作收集全部肠道内容物于1.5 mL的EP管中，并迅速放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.5 肠道菌群16S rRNA的V3-V4区扩增及测序

从每组10个样本中随机取3个大鼠肠道内容物采用Tiangen总DNA抽提试剂盒提取DNA并作为模板；采用16S rRNA的V3-V4区引物进行PCR扩增，产物送往上海百趣公司进行测序。PCR上游引物338F序列：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，下游引物806R序列：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

1.6 数据分析

对测序结果双端合并后，用Vsearch(2.14.1)切除引物及去冗余[6]。数据用Usearch10的unoise3进行Amplicon Sequence Variants(ASV)非聚类去噪[7]，生成Operational Taxonomic Unit(OTU)，基于Silva数据库去除嵌合体，生成OTU表，基于rdp数据库进行物种注释(置信值>0.6)。用Alpha、Beta和Linear discriminant analysis Effect Size(LEfSe)方法对肠道菌群进行多样性及物种分类的差异性进行分析[8]；用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2(PICRUSt2)进行功能预测分析[9]。

2 结 果

2.1 测序结果

经过双端合并后去除质量错误值大于0.01，并去冗余后共得到4 960条特征序列。经过silva数据库去除嵌合体得到833条代表性序列，其序列长度最小值为387 bp，最大433 bp，平均416 bp，基本与16S rDNA v3-v4区的长度相符合。

2.2 Alpha多样性

经过抗生素处理的SD大鼠的Chao1指数与对照组相比显著升高(P<0.05)，提示抗生素能提高细菌物种的丰富度；而抗生素各组之间无显著差异(P>0.05)，见图1A。Alpha稀释曲线出现平台期，说明本次测序深度充分，见图1B。

2.3 Beta多样性

采用PCoA(principal co-ordinates analysis,主坐标轴分析)和CCA(Constrained PCoA，限制性主坐标轴分析)方法分析bray-curtis数据，结果表明各组间菌群结构存在显著差异(P<0.01)，见图2。

2.4 肠道菌群结构分析

通过肠道菌群结构分析，结果表明正常的SD大鼠的厚壁菌门(Firmicutes)占总菌群比例的的97%，抗生素使用后厚壁菌门的比例下降，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度上升，见图3。在抗生素使用超过一周后，肠道厚壁菌门的丰度出现逐渐上升的趋势，变形菌门和放线菌门的丰度出现下降的趋势，见图4。

2.5 组间Lefse差异分析

通过Lefse(设置LAD值>2)分析找到各组间具有显著差异的细菌类群。在属水平下，M0组与M1有16种物种表现出显著差异，真杆菌属(Eubacterium)、未定的毛螺菌属(Lachnospiracea_incertae_sedis)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、布劳特氏菌(Blautia)、肠球菌属(Enterococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、志贺菌(Escherichia_Shigella)，链球菌属(Streptococcus)和罗斯氏菌属(Rothia)在M1组富集 ；乳杆菌属 (Lactobacillus)，Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto和Turicibacter在M0组富集，见图5A。

M0与M2有14种物种表现出显著差异，肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根菌属(Morganella)、Clostridium_XlVa、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis、Terrisporobacter、Escherichia_Shigella和布劳特氏菌(Blautia)在M2中富集；链球菌属(Sireptococcus)、Clostridium_sensu_stricto、Clostridiaceae_1、罗斯氏菌属(Rothia)、Turicibacter和乳酸杆菌属(Lactobacillus)在M0中富集，见图5B。

M0与M3有10种物种表现出显著差异，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、布劳特氏菌(Blautia)、Escherichia_Shigella、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、Clostridium_XlVa、摩根菌属(Morganella)和Terrisporobacter在M3中富集；罗斯氏菌属(Rothia)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)在M0中富集，见图5C。

2.6 功能预测

使用PICRUSt2软件对OTU进行功能预测，其结果通过STAMP 软件分析，并进行Welch's t检验，经过FDR校正得出结果，M3与M0组的代谢通路无差异。 M1组肠道菌的N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰神经氨酸降解的超途径(superpathway of N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine and N-acetylneuraminate degradation)、尿素循环(urea cycle)通路显著下降； Menaquinol-7生物合成的超途径(superpathway of menaquinol-7 biosynthesis)，Menaquinol-12生物合成的超途径(superpathway of menaquinol-12 biosynthesis)，己糖醛酸和己糖酸酯降解的超途径(GALACT-GLUCUROCAT-PWY)通路显著上升。M2组肠道菌甘油降解为1,3-丙二醇的超级途径(superpathway of glycerol degradation to 1,3-propanedio)通路显著降低，甲酰基-四氢叶酸的生物合成(N10-formyl-tetrahydrofolate biosynthesis)，甲苯降解III(好氧)(通过对甲酚)(toluene degradation III (aerobic) (via p-cresol))通路显著上升，见图6。

3 讨 论

抗生素在治疗细菌感染时会引起的肠道菌群结构改变，一方面会使得条致病菌的定植而引起疾病，另一方面也会增加某类益生菌的丰度[10]。本研究采用临床β-内酰胺类的抗生素氨苄西林钠，探讨抗生素对肠道菌群结构和功能的影响，旨在为临床合理应用抗生素提供实验依据。

厚壁菌门是健康宿主的共有的优势菌群[11]，而抗生素的使用极大降低了厚壁菌门的丰度，本研究得出相同的结果[12]。在抗生素使用1周以后SD大鼠肠道乳杆菌属和Romboutsia等厚壁菌门的物种丰度呈现上升趋势。乳杆菌属是存在于肠道内的有益菌，可以协助消化为机体提供营养、助治疗腹泻和皮肤病[13]；乳酸菌在肠道菌群中形成的生物膜，能够使该菌在恶略的环境中持久存在并维持足够的丰度，并抑制病原菌的定植[14]。

据报道Romboutsia可作为宿主肠息肉的特异性生物标记物[15]，然而抗生素的使用与结肠息肉的患病风险呈正相关[16]，这些结果提示抗生素有可能是通过降低肠道内Romboutsia丰度增加了结肠息肉患病的风险。

近年来发现,儿童青少年是抑郁症患病高风险人群,除了社会及家庭环境的影响，有报道显示抗生素的使用能增加儿童患抑郁症的风险[17]。毛螺菌属和布劳特氏菌属在抑郁症患者中属于特异性菌属，可作为生物特异性标志物[18]。本次实验抗生素组中上述两种细菌的富集，进一步肯定了抗生素与抑郁症的关联性。

Shen等[19]研究表明，布劳特氏菌属的丰度在非酒精性脂肪肝患者具有更高的丰度。在本研究中使用抗生素增加了劳特氏菌属的丰度。综合这些研究结果考虑，对于非酒精性脂肪肝患者在抗生素时应该慎重考虑，以免加重病情。

帕金森病发展的形势十分严峻，而其发病机制目前尚未明确，因此挖掘出帕金森病的生物学标志物将会给其诊断及治疗带来显著意义，近年有研究发现，帕金森病可能起源于肠道[20]。毕早安研究发现Terrisporobacter在帕金森病人的肠道中丰度明显低于正常组[21]。本次实验中抗生素氨苄西林钠能够提高Terrisporobacter的丰度。提示氨苄西林钠有可能通过改善肠道Terrisporobacter数量来治疗帕金森病。

通过PICRUSt2预测肠道菌群功能，结果显示氨苄西林钠能够提高甲酰四氢叶酸的合成以及降低尿素的循环。目前，甲酰四氢叶酸已作为白血病化疗过程中的一种生物调节剂[22]，提示抗生素有望成为治疗白血病的辅助药物。尿素循环障碍可导致高氨血症[23]，故建议高氨血症患者应禁用抗生素氨苄西林钠。

综上所述，抗生素使用一周后显著改变了肠道菌群的结构，但随着用药时间的增长，对肠道菌群结构的影响逐渐减弱；抗生素在治疗细菌感染性疾病时增加了结肠息肉、抑郁症和非酒精性脂肪肝的的发病风险，但对白血病和帕金森疾病可能具有一定潜在的治疗价值。这些结论与中医学上的“异病同治”的理论不谋而合。