滩羊肌内前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

徐小春，陈文娟，赵 瑞，马 森

(1.北方民族大学 生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021；2.河南农业大学 动物科技学院，河南 郑州 450002)

滩羊肌肉大理石纹的形成主要是由于肌内脂肪沉积，并与肌肉嫩度、多汁性和风味等肉质相关指标紧密相关[1]。 存在肌内脂肪中的一些脂类及脂溶性物质是肉质风味物质的前体物，也是肉质风味形成的重要基础[2]。因此，以滩羊肌内前体脂肪细胞为模型，研究前体脂肪细胞成脂分化过程的调控机制，探讨肌内脂肪的生成规律对改善肉质、提高羊肉的食用价值具有重要意义。前体脂肪细胞具有增殖和分化的特性，在其分化过程中受到一系列转录因子及酶(过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(aP2)、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白脂酶(LPL)等)的调控作用[3-5]。前体脂肪细胞在分化的过程中形态发生变化，同时相关基因表达也发生变化，最终分化为成熟脂肪细胞，脂质在胞质内积累[6]。相较于脂肪组织来源的前体脂肪细胞，肌内来源的细胞更适宜作为细胞模型模拟体内肌内脂肪前体细胞增殖和分化的过程及了解与该过程相关的调控机制[7-8]。因此，建立滩羊肌内脂肪前体细胞的体外培养体系是解析该细胞增殖和分化相关调控机制的基础性工作，也可以为通过营养和遗传等途径调节肌内脂肪沉积提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与主要试剂

选取10日龄健康无病的滩羊1只(宁夏盐池县某专业合作社提供)，颈部处死后无菌条件下采取背最长肌组织，放于添加双抗的(青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL)无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中备用。0.2%Ⅱ型胶原酶(Gibco，美国)，胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)、DMEM/F12培养基(Sigma, 美国)，0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)，青链霉素(Gibco，美国)，OriCell SD大鼠脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen Biosciences，中国)，油红O染料(Sigma，美国)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma, 美国)，RNA提取试剂盒(Takara，日本)，反转录试剂盒(Takara，日本)，实时荧光定量qPCR Mix(Takara，日本)等。

1.2 滩羊肌内前体脂肪细胞分离培养

用75%的酒精消毒采样部位，采取背最长肌组织，放置含有双抗的PBS溶液冲洗5次。在无菌培养皿中剔除肉眼可见的血管和结缔组织，将组织剪成约1.0 mm左右的组织块，加入0.2%Ⅱ型胶原酶置于37 ℃水浴锅中消化1.5 h，每5 min振荡1次，消化完全后加入等体积的完全培养基(DMEM/F12+10% FBS+100 IU/mL青链霉素)终止消化。消化液依次过200目、400目孔径的细胞筛，滤液1 500 r/min离心10 min，弃上清。完全培养基重悬细胞置于CO2培养箱内培养3～4 h之后换液，贴壁细胞即为肌内前体脂肪细胞，之后每隔1 d换液1次。

1.3 滩羊肌内前体脂肪细胞传代培养

原代细胞培养汇合度为80%左右时，PBS洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，在显微镜下观察细胞回缩且少量飘起，此时加入胰蛋白酶2倍体积的完全培养基终止消化。1 000 r/min离心10 min，弃上清，完全培养基重悬细胞，按1∶2或1∶3的比例进行传代培养，置于37 ℃，5% CO2培养箱中，每隔2 d换液1次，直到细胞培养汇合度为90%铺满整个培养皿。

1.4 滩羊肌内前体脂肪细胞生长曲线的测定

原代细胞培养汇合度为80%左右，胰蛋白酶消化细胞后收集并重悬，接种至96孔培养板内，每孔密度为1.0×105个/mL，随机分为7组，每组3孔。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)法测定细胞活力：细胞培养皿每孔加入20 μL MTT溶液，放置37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h，PBS洗去MTT溶液，加入150 μL DMSO，测定490 nm波长处的OD值。每隔48 h进行测定一次，用每孔吸光度值的平均值绘制曲线，即为原代肌内脂肪细胞的生长曲线。

1.5 滩羊肌内前体脂肪细胞诱导分化

第二代细胞汇合至80%时进行成脂诱导分化，加入OriCell SD大鼠脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基A液72 h，换以OriCell SD大鼠脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基B液培养24 h，A液和B液交替作用2次(8 d)。

1.6 油红O染色鉴定及脂肪含量的测定

肌内前体脂肪细胞诱导成为成熟脂肪细胞后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，油红O染色60 min，PBS洗2次，倒置显微镜下观察。之后60%异丙醇进行萃取，测定萃取液在510 nm波长处的OD值。

1.7 引物设计及合成

参照GenBank中PPARγ、C/EBPα、FAS、aP2、LPL基因序列，用Primer Premier 5.0及NCBI设计qRT-PCR特异性引物，引物相关信息见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.8 实时荧光定量PCR

分别在肌内前体脂肪细胞诱导第0、2、4、6、8天提取总RNA，利用PrimeScript○RRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以β-actin为内参基因，qRT-PCR方法检测脂肪细胞成脂分化关键基因mRNA的相对表达水平。PCR反应体系20 μL：其中Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，用ddH2O补足体系。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，39个循环；65～95 ℃熔解曲线5 s。

1.9 数据处理

数据均以“平均值±标准差”表示，采用Graph Pad Prism 5统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析，采用Graph Pad Prism 5软件作图，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 前体脂肪细胞的形态学观察

采用差速贴壁法处理细胞，得到纯化的滩羊肌内前体脂肪细胞。细胞分离后4 h开始贴壁(图1A)；2 d后细胞形态均一，大部分呈现梭形(图1B)；6 d后细胞生长旺盛呈现长梭形(图1C)；培养至8 d时，细胞呈现长梭形且平行排列紧密(图1D)。培养汇合至90%时传代培养，传代第2天、4 d细胞呈现梭形及不规则三角形(图2A、图2B)；传代培养至第6 d，细胞生长旺盛且呈现长梭形(图2C)；传代培养8 d后，细胞平行排列紧密(图2D)，与原代培养第8天形态基本一致。

2.2 诱导分化及油红O染色鉴定

滩羊肌内前体脂肪细胞诱导分化2 d后，细胞由梭形逐渐变为椭圆形(图3A)；诱导分化4 d时，细胞的成脂分化趋势较为明显(图3B)；诱导分化6 d，出现少量的脂滴(图3C)；诱导培养8 d，脂滴出现明显(图3D)。诱导分化后的细胞进行油红O染色鉴定，细胞内脂滴被油红O着色而成红色，说明肌内前体脂肪细胞已经被成功诱导分化为成熟脂肪细胞(图3E和图3F)。

2.3 生长曲线

肌内前体脂肪细胞生长曲线形状近似“S”型(图4)，细胞增殖过程分别为潜伏期、指数生长期和平台期，符合一般细胞的生长规律。在细胞接种后0～2 d生长缓慢，2～6 d 迅速增殖，为指数生长期，8 d后进入平台期(图4)。

2.4 脂肪含量测定

采用油红O染色法对肌内前体细胞内脂肪含量进行检测，由图5可知，细胞诱导第2 d出现脂滴，随诱导时间的增长脂肪含量逐渐增加，诱导第12 d时细胞内脂肪含量最高(图5)。

2.5 脂肪相关基因表达检测

由图6可见，在肌内脂肪前体脂肪细胞的诱导分化过程中，PPARγ在诱导第4 d和6 d的表达水平显著高于诱导0 d、2 d、8 d 的表达水平(P<0.05)；C/EBPα在诱导分化4 d的表达水平最高，显著高于0 d、2 d、6 d、8 d的表达水平(P<0.05)；FAS基因在诱导6 d的表达水平显著高于诱导0 d、2 d、4 d、8 d 的表达水平(P<0.05)；aP2基因在诱导分化4 d的表达水平最高，显著高于0 d、2 d、6 d、8 d的表达水平(P<0.05)；LPL基因在诱导4 d和6 d的表达水平显著高于0 d、2 d、8 d的表达水平(P<0.05)。随着分化时间增长，PPARγ先升高后降低，FAS先降低后升高再降低，C/EBPα和LPL先升高后降低，aP2先升高后降低再升高。

3 讨 论

3.1 肌内前体脂肪细胞分离培养

酶消化法和组织块培养法是从特定组织分离培养细胞的常用方法[9-10]，本研究采用Ⅱ型胶原酶消化分离获得了呈梭形及不规则三角形的前体脂肪细胞，其成分均一、增殖和分化能力较强。与组织块培养法相比，Ⅱ型胶原酶消化法在5～7 d内细胞可生长至至80%汇合度，短期内即可获得大量纯度较高的细胞。但酶消化法也容易混杂其他种类细胞，细胞原代培养的污染率较高，该缺点可经过差速贴壁及传代对细胞进行进一步纯化而弥补。本研究根据山羊[11]、牛[12]、猪[13]、兔[14]的肌内前体脂肪细胞的培养条件，利用酶消化法分离得到的肌内前体脂肪细胞贴壁性能良好，贴壁率可达到50%左右，24 h后可达到80%左右。该结果表明本研究分离的滩羊肌内前体脂肪细胞生长状态良好，能够在体外大量增殖。

3.2 肌内前体脂肪细胞生长曲线

细胞生长状态通常用生长曲线来观察，生长曲线也是评价细胞活力的重要指标之一。一般细胞传代贴壁后，经过潜伏期，随即进入指数生长期，此时细胞大量分裂。当细胞达到饱和便停止生长，随即进入平台期，最后退化衰亡进入抑制期。细胞的生长过程包括：潜伏期、指数生长期、平台期和抑制期。细胞接种的密度直接影响细胞潜伏期的长短，接种密度过小，细胞生长缓慢，则潜伏期长；细胞密度过大，则潜伏期短，导致细胞过早进入抑制期[15]。为了准确描述细胞数量在整个生长过程中的动态变化，本研究用96孔板以1.0×105个/mL密度接种细胞，接种后24 h换液，细胞贴壁性能良好，细胞经历2 d的潜伏期，第3天开始迅速增殖，第6天进入平台期，第8 d细胞密度持续增大，代谢产物增加，导致部分细胞脱落死亡，此时进入细胞衰亡期，生长曲线近似“S”型，符合细胞的正常生长规律。

3.3 肌内前体脂肪细胞的诱导分化及鉴定

前体脂肪细胞无论在体内还是体外都具有自发成脂的潜能，过度融合能够促进细胞的成脂分化[16-17]。前体脂肪细胞的成脂分化过程受到不同调节因子和转录因子的调控[18-19]。不同的激素和生长因子与前体脂肪细胞表面的特异受体结合后，直接或间接通过不同的信号通路来调控脂肪细胞的分化[20]。细胞内甘油三酯与油红O特异性结合使脂滴染色变成橘红色，因此可作为体外培养前体脂肪细胞的鉴定及分化状态的分析[11]。本研究结果表明，传代培养细胞在汇合至80%后用成脂诱导分化培养基诱导，细胞内呈现小脂滴，油红O染色后呈红色，说明分离得到的细胞为肌内前体脂肪细胞。细胞在诱导培养2 d后开始有小脂滴出现，4 d后小脂滴迅速聚集，6 d后小脂滴大量出现，这与脂肪在细胞内的形态学变化完全一致。

3.4 肌内前体脂肪细胞成脂分化关键基因时序表达

前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞受到多种转录因子调控，尤其受到PPARγ、C/EBPα及其家族转录因子的密切调控[21]。研究发现，小鼠3T3-L1前脂肪细胞通过下调PPARγ基因的表达，抑制其向成熟脂肪细胞分化[22]。本研究发现，PPARγ在肌内前体脂肪细胞诱导第6天时表达水平最高，之后逐渐下降。在江香猪肌内脂肪前体细胞中，PPARγmRNA表达水平在整个分化早期时均呈现较高表达，之后显著降低，此研究结果与本研究结果一致，但其表达水平在第3 d时最高[23]。上述结果表明，肌内前体脂肪细胞诱导分化后期PPARγ的表达可能受到抑制。LPL是甘油三酯(Triglyceride，TG)代谢中的关键酶，对脂肪沉积起重要的调控作用。改变LPL表达水平可能会影响全身代谢和神经元脂质生物学功能[24]。本研究发现，LPL在肌内脂肪前体细胞分化早期表达差异显著，中期差异不显著，但出现大幅度上调，后期有所下降。此研究结果与孙成娟等[23]研究结果相反，这可能是由品种间的遗传差异造成的。FAS在脂肪酸的合成中发挥重要作用，是一种脂肪生成酶。在3T3-L1前体脂肪细胞中，青蒿琥酯通过降低C/EBPα、PPARγ、FAS、perilipin A和STAT-3的表达和磷酸化水平抑制脂肪生成[25]。本研究发现，FAS在肌内脂肪前体细胞诱导分化的第6天呈现较高表达，显著高于其他时期的表达水平，这与FAS江香猪肌内脂肪前体细胞中的表达规律结果一致。干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内脂肪细胞中脂滴的聚集，并且脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、LPL、aP2的表达水平显著上升[26]。本研究结果表明，C/EBPα和aP2在前体脂肪细胞分化第4天表达最高，均呈现先升高后降低的趋势，这与PPARγ和LPL的表达规律一致。

4 结 论

本研究通过胶原酶消化法分离细胞，利用差速贴壁法对细胞进行纯化，成功构建了滩羊肌内前体脂肪细胞的体外分离培养体系。所分离的细胞经过传代后纯度较高，增殖和分化能力较强。诱导分化通过油红O鉴定所分离的细胞为肌内前体脂肪细胞，成脂关键基因PPARγ、C/EBPα、FAS、aP2、LPL在肌内前体脂肪细胞的分化中、后期均呈现较高水平表达，这为后续体外研究滩羊肌内脂肪代谢以及沉积机理奠定了良好的基础，对进一步研究滩羊脂肪沉积机制具有重要意义。