大河乌猪MSTN基因第3外显子多态性与眼肌面积的关联分析

2020-12-04牛元力李志勋秦建鹏邱丙姗赵桂英

家畜生态学报 2020年11期

程娜，牛元力，李志勋，龙罡，秦建鹏，邱丙姗，赵桂英*，李祥*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南东恒经贸集团猪育种有限公司，云南曲靖 655000)

大河乌猪是大河猪与杜洛克猪杂交选育而成的培育品种。其具有肉质细腻、肌间脂肪含量高等特性[1]。但其瘦肉率与生长速度较大白猪、杜洛克猪和长白猪等外来猪种仍有较大差距。猪眼肌面积大小与猪的胴体瘦肉率有高度的相关性，是提高猪生产性能的重要指标之一[2]。

肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)属于转化生长因子(transforming growth factor，TGF-β)超家族成员。MSTN主要分布在骨骼肌中，对骨骼肌的生长和分化有重要的调控作用，可能对瘦素的产生以及分泌有影响[3]。Magdalena等[4]研究发现在卡缅涅茨羊和波美拉尼亚羊中MSTN基因均存在多个SNP位点，并且某些多态性位点可以作为生长性状的遗传标记。Kambadur R等[5]在对比利时蓝牛的研究中发现，MSTN基因编码区11个碱基的插入，是比利时蓝牛双肌臀产生的重要原因。最早Sonstegard等[6]通过将MSTN基因定位于猪的第15号染色体上，构建了猪第15号染色体的连锁图谱。猪MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成，李绍华等[7]采用PCR-SSCP技术研究猪MSTN基因时发现第2外显子和第3外显子均存在多态性。MSTN基因对瘦肉率及肌肉生长有重要影响。本试验通过对大河乌猪MSTN基因第3外显子多态性的研究，找出与眼肌面积关联分析的高产基因型，为大河乌猪瘦肉率提供分子标记位点，加快大河乌猪选育进程。

1 材料与方法

1.1 试验地点

本试验于2019年在云南农业大学动物科学技术学院318猪生产研究室进行。

1.2 试验材料

试验选用饲养管理、环境条件一致的不同家系，同胎次，产仔日期相近，体重均达100 kg左右的育肥大河乌猪79头。采集其活体耳组织，并将采集的耳组织放入1.5 mL的Eppendorf试管中，加入75%的乙醇，-20 ℃储存备用。

将采集耳组织的79头大河乌猪屠宰，测定其眼肌面积，测定部位为胸腰椎结合处，测定方法为眼肌的长、高，并做好相关记录，眼肌面积=长×高×0.7。

1.3 耳组织中DNA的提取

提取耳组织中DNA的方法采用常规酚/氯仿法，具体参照《分子克隆实验指南》[8]。

1.4 DNA原液的检测

检测时制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳，取4 μL待检测的DNA原液和1 μL 10x Loading buffer混合进行点样，第一孔加入DNA Marker(DL 2000)5 μL作为参照，120 V稳压电泳20 min，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察有无DNA条带及亮度情况，以检测DNA是否提取成功，将提取成功的DNA原液储于4 ℃保存待用。

1.5 MSTN基因第3外显子PCR引物设计

根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公布的猪MSTN基因序列(GENE BANK ID：EF490990)，选取一段包含第3外显子的序列，长度为439 bp。使用NCBI blast功能查找基因突变位点，发现MSTN基因第3外显子有两个突变位点：①第3外显子63 bp处C-T的突变；②第3外显子92 bp处G-A的突变。使用DNA CLUB软件查找酶切位点发现突变的两个点都位于TaqI酶识别的限制性位点(TCGA)。使用Premier 5.0软件设计大河乌猪MSTN基因第3外显子的引物，上游引物为5'-AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGAT-3'，下游引物为5'-GAGCACCCACAGCGATCTAC-3'，将设计好的引物序列送往擎科生物技术有限公司合成。

1.6 MSTN基因第3外显子PCR反应体系

创建25 μL 的PCR反应体系，其中1.1×T3 Super PCR Mix 21.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、DNA原液(模板)1.5 μL。98℃预变性2.5 min，98 ℃变性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸6 s，共35个循环，最后72 ℃延伸2 min，产物用1%琼脂糖凝胶检测。将符合下一步实验要求的样品放置于4 ℃保存。

1.7 MSTN基因第3外显子测序

将MSTN第3外显子DNA样品送往北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序。利用DNAMAN 进行序列比对，在NCBI中下载大猩猩(DQ927204)、黑猩猩(DQ927196)、骆驼(KJ847844)、马(KC708233)、穴兔(GU244575)、绵羊(KT832792)、山羊(EF423557)的基因序列，并构建系统发育树。

1.8 MSTN基因第3外显子PCR-TaqI-RFLP的反应体系

创建25 μL 的酶切反应体系，其中PCR产物19 μL、限制性内切酶TaqI1 μL 10×LoadingBuffer 2 μL、ddH2O 3 μL。将配置好的反应体系置于37 ℃的水浴锅6 min，反应终止后取出。制备3%的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察检测到两种基因型。

1.9 眼肌面积计算

使用Excel表格，根据大河乌猪基因型，整理眼肌面积和屠宰体重的原始数据，用SAS9.0软件的GLM(General Linear Model))过程，配合下列回归方程进行协方差分析，数据表示为平均值±标准误( X±SE)。眼肌面积(y)与屠宰体重(x)间直线回归方程：y=14.98+0.16x。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

大河乌猪耳样中提取的DNA原液经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后置于凝胶成像系统中观察，结果显示基因组DNA条带清晰明亮、整齐没有拖尾现象，浓度均匀、质量较好，符合PCR扩增试验要求(图1)。

2.2 MSTN基因第3外显子PCR扩增结果

由图2可见，大河乌猪MSTN基因第3外显子的PCR产物均为439 bp的单一条带，无非特异性扩增，条带清晰、明亮，符合所要扩增的目的片段大小，可以进行后续的酶切试验。

2.3 MSTN基因第3外显子PCR-TaqI-RFLP反应结果

由图3可见，PCR产物经限制性内切酶TaqI酶切后呈现多态性，分为2种基因型，一种是含有439、315、287、152、124、28 bp六个条带的CTGA基因型，另一种是含有287、152、124、28 bp四个条带的CTGG基因型。因28 bp片段长度过小，无法观测到，但不影响基因型的判断。

2.4 大河乌猪MSTN基因第3外显子基因型与眼肌面积关联分析

由表1可见，CTGG基因型大河乌猪的眼肌面积比CTGA基因型大河乌猪大4.37 cm2，差异极显著(P<0.01)。

表1 大河乌猪MSTN基因第3外显子基因型与眼肌面积的关联分析Table 1 Association analysis of exon 3 of MSTNgene and eye muscle area in Dahewu pig

2.5 大河乌猪MSTN基因的群体遗传特性

在大河乌猪的两个基因型中，CTGG的基因型频率为0.1266，CTGA的基因型频率为0.8734，其中G等位基因频率为0.5633，A等位基因频率为0.4367。MSTN基因在大河乌猪试验群体中呈中度多态性(0.25

表2 大河乌猪MSTN基因的群体遗传信息Table 2 Population genetic information of MSTN gene in Dahewu pig

2.6 序列比对结果

大河乌猪CTGA基因型与CTGG基因型序列比对结果如图4所示，全部的大河乌猪63位碱基都发生了由C-T的突变，只有部分大河乌猪92位发生了由G-A的突变。

2.7 系统发育分析

由图5知，大河乌猪与穴兔的亲缘关系最近，骆驼与马亲缘关系最近，大猩猩与黑猩猩的亲缘关系最近，但大猩猩、黑猩猩、骆驼和马较大河乌猪亲缘关系较远。

3 讨论

MSTN基因在进化中相对保守，在其他动物的研究上已证实该基因失活会导致骨骼肌过度发育。胡师金等[9]检测到绵羊MSTN基因第3外显子G-A的突变位点，经关联分析表明，其突变为点与绵羊体重、管围、背膘厚和眼肌面积显著相关。刘桂芬等[10]在对渤海黑牛MSTN基因多态性位点检测中发现第3外显子G-A、C-T的两个多态性位点，与体尺关联分析后发现MSTN的作用除了在肌肉方面也可能在体尺方面有体现。Kambadur等[11]在皮埃蒙特牛中同样发现了G-A的突变，而且突变个体均表现为“双肌臀”特征。

通过对大河乌猪MSTN基因第3外显子酶切结果和序列比对结果分析发现，全部大河乌猪63位碱基均发生了C-T的突变，部分大河乌猪92位碱基发生了G-A的突变。易恒洁等[12]研究发现，在高坡猪MSTN基因第3外显子中存在C-T的突变位点,但其为同义突变，并未引起氨基酸的改变。Jiang等[13]通过用PCR-SSCP法对猪整个MSTN基因进行多态性检测，发现外显子中C-T的突变位点，并且证实了这种突变在西方猪种少见在中国地方猪种多见，但对于是否与瘦肉率有关需进一步研究。李绍华等[7]以47头“双肌臀”大白猪为研究对象，在对其MSTN基因的研究中发现，虽然第3外显子的突变为沉默突变，但可初步证实该突变可使猪具有更低的背膘及更高的瘦肉率，这可能与突变后该处产生的内切酶位点有关。黄艳娜等[14]在对陆川猪MSTN基因的研究中发现存在G-A的突变，与本研究结果一致。但刘晓琴等[15]在对长白猪、大白猪、杜×长×大三元杂、通城猪、莱芜猪、五指山猪六个猪种MSTN基因的克隆测序中，并未在MSTN基因外显子区域检测到突变位点，与本试验结果不一致，这可能是由于猪种差异所导致的。

本试验研究发现猪和穴兔的亲缘关系最近，杨光有等[16]研究发现猪疥螨与兔疥螨分离株同源性较高，Walton等[17]通过应用微卫星标记对人和犬疥螨的同源性研究，发现疥螨的这些遗传因子的突变是由特定的宿主决定的, 而并非地理环境所决定。由此证实，猪和兔的亲缘关系较近，与本试验结果一致。本研究系统进化分析显示，骆驼和马的MSTN基因第3外显子序列差异性较小、黑猩猩和大猩猩MSTN基因第3外显子亲缘关系最近，与绵羊和山羊的差异性较大、亲缘关系较远，说明MSTN基因的突变可能与动物体尺大小有关。

大河乌猪63位碱基全部发生突变，但前人研究发现MSTN基因第3外显子不发生突变[18-20]或部分发生突变[21]，这可能与奠基者效应有关[22-24]。通过对大河乌猪MSTN基因第3外显子92位G-A碱基突变与眼肌面积关联分析发现，突变个体极显著提高了大河乌猪的眼肌面积，与前人研究结果一致[25]。这说明大河乌猪MSTN基因第3外显子92位的碱基突变是一个有价值的标记为点，值得在大河乌猪育种中应用于辅助标记选择。因此，MSTN基因可以作为大河乌猪眼肌面积的候选基因。可以选择和保留更多的CTGG型大河乌猪，以提高其瘦肉率。