miRNA-155与TP53INP1 mRNA在非小细胞肺癌患者胸水脱落细胞中的表达及其临床意义

李威 史小芳 崔晶刚 林盪 周俊东

微小RNA(miRNA)是一种真核生物中广泛存在的长度约22nt的内源性短链RNA分子，无法进一步转译成蛋白质的RNA，可通过与靶信使mRNA的3’UTR区域互补结合，从而抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用[1]。本研究实时定量PCR方法测定胸水中TP53INP1 mRNA与miRNA-155的表达，分析其表达在非小细胞肺癌合并恶性胸腔积液患者临床意义以及预后相关性。现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年2月至20017年6月在南京医科大学附属苏州医院呼吸内科住院的恶性胸腔积液患者42例，男22例、女20例，年龄30岁～69岁，平均(54.3±4.1)岁。细胞学或组织病理学证实，其中腺癌26例、鳞癌16例，均为初治患者。选取良性胸腔积液患者21例，男13例、女8例，年龄18岁～70岁，平均(45.7±8.2)岁。其中结核性胸膜炎8例、肺炎7例、心衰4例、尿毒症2例。良性胸腔积液诊断均经过细胞学、影像学检查及临床随访证实。

1 标本采集

征得受试者知情同意后，对患者常规胸腔B超定位后行胸腔穿刺术，留取第2，3管胸水50mL分别置于两个肝素抗凝瓶中。提取分离试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。按操作步骤提取胸腔积液RNA。

2 研究方法

引物及内参: 带有柄环结构的引物由广州锐博生物科技有限公司提供，参考Chen等[2](见表1)。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) : 提取总RNA、反转录cDNA 和 cDNA 样品作为模板，检测胸水脱落细胞中TP53INP1 mRNA、miRNA-155。反转录系统: 逆转录buffer 2ul、引物0.2ul、dNTP 0.1ul、逆转录酶MMLV 0.5 ul、DEPC水5 ul、RNA模版 2 ul、总体积10 ul，逆转录成cDNA放置-20℃保存备用。实时定量荧光PCR,SYBR Green染料10ul、上游引物1 ul、下游引物1 ul、dNTP 1ul、Taq聚合酶2ul、待测样品cDNA 5ul、ddH2O 30 ul、总体积50ul(94℃ 15s，60℃ 60s) 50个循环，每个循环结束时PCR仪自动检测一次荧光值。在实时荧光定量PCR技术中，计算机自动输出每个cDNA模版标本的扩增曲线、CT值。由软件自动计算待测样品,TP53INP1mRNA与miRNA-155,U6RNA含量。以U6RNA作为内参，采用实时定量PCR中的相对定量法，以N=2-△Ct表示胸水miRNA相对表达量，其中△Ct表示mRNA与内参U6RNA的CT之差。

二、统计学处理

表1 RT-PCR引物序列及内参

结 果

一、TP53INP1mRNA与miRNA-155在恶性胸水及良性胸水的表达及其相关性

表2 miRNA-155 和TP53INP1mRNA在良恶性胸水脱落细胞表达水平

二、恶性胸腔积液TP53INP1mRNA及miRNA-155的表达与临床病理参数关系

恶性胸腔积液miRNA-155及TP53INP1mRNA表达与患者年龄，性别、肿瘤类型、肿瘤直径及淋巴结是否转移无相关性，恶性胸腔积液miRNA-155及TP53INP1mRNA表达与肿瘤分化程度存在相关性，肿瘤低度分化组miRNA-155表达明显高于高度分化组，差异有统计学学意义(见表3)。

三、恶性胸腔积液 miRNA-155的表达与临床预后关系

42例恶性胸腔积液随访日期至2019年6月，结果42例恶性胸腔积液患者全部死亡，中位生存时间为321天。依据miRNA-155表达水平，将42例恶性胸水患者平均分为高表达组，低表达组。两组患者随访期间治疗情况及意外死亡事件发生率差异无统计学意义(见表4)。miRNA-155表达与患者生存时间明显相关，高表达组生存时间明显长于低表达组，高、低表达组中位生存时间分别为253d、383d，两组差异有统计学意义(见图1)。

表3 TP53INP1mRNA的表达与非小细胞肺癌的临床病理参数关系

表4 非小细胞肺癌患者miRNA-155高表达组与低表达组治疗情况

图1 恶性胸腔积液miRNA-155表达亚组的生存分析

讨 论

miRNA在物种间具有较高的保守性、时序性和组织特异性，可能参与决定细胞和组织的功能特异性。miRNA的生物学功能主要通过调控靶基因的表达来实现的，它们与靶基因组成了一个复杂的调控网络，控制细胞及个体的重要生命活动[3]。

大量研究证实miRNA-155在甲状腺癌[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、结肠癌[7]等多种癌组织、血液，体液中高表达。本课题组前期的实验结果也提示检测胸水miRNA-155的表达对诊断恶性胸水具有较高的特异性、敏感性，对恶性胸水的诊断具有一定的价值[8]。本研究采用实时定量PCR技术检测miRNA-155在NSCLC胸水中表达量，分析其与恶性胸腔积液患者临床病理特征相关性，未发现与性别，年龄，病理类型，肿瘤大小、淋巴结是否转移的相关性，但发现高miRNA-155表达与肿瘤细胞低度分化有关，提示miRNA-155可能参与肿瘤细胞分化等生物学过程。本研究miRNA-155表达与患者生存时间单因素相关性分析，两组患者随访期间治疗方案及意外死亡事件发生率差异无统计学意义，恶性胸水组中miRNA-155高表达组、低表达组中位生存时间分别为253d、383d，两组差异有统计学意义。提示miRNA-155高表达提示恶性胸水患者生存时间减少，预后差，与Yanaihara等[9]和Donnem等[10]的两项非小细胞肺癌临床研究文献报道相符。Yanaihara等[9]研究了64例一期的肺腺癌患者，发现高miRNA-155和低let-7的表达是独立的预后负面预测因子。Donnem等[10]采用原位杂交技术研究191例鳞癌，95例腺癌，31例大细胞癌和18例肺泡细胞肺癌患者，研究结果提示，miRNA-155在癌组织较癌旁组织中表达上调，miRNA-155在各种病理亚型中无显著性差异，miRNA-155高表达组患者生存率明显下降。本研究不足之处，由于初始资料样本量限制，缺少亚组生存分析，以及多因素回归分析，有待样本量扩大，进一步研究。

TP53INP1是一种转录因子，TP53INPl能与P53、P73相互作用，诱导Caspase-3级联反应来介导细胞凋亡,在细胞应激极化时表达上调,能使细胞周期发生停滞，通过抗增殖、促凋亡来调节细胞稳定性[11]。应用生物信息学方法，miRNA-155靶向调节TP53INP1,miRNA-155与TP53INP1 mRNA3’-UTR结合，引起mRNA翻译中止，或诱导其降解，调控基因表达[12]。Gironella等[13]在对胰腺癌的研究中发现，miRNA-155在胰腺癌组织中的表达明显高于正常组织，miRNA-155能在转录水平调节TP53INPl，抑制内源性TP53INPl的表达，促进肿瘤的发生。本研究发现恶性胸水患者miRNA-155表达与胸水细胞TP53INP1mRNA呈负相关，提示miRNA-155可能通过调控TP53INP1通路，从而在肺癌发生中起癌基因的作用，但是miRNA-155在肺癌中是否还调控其他信号通路及具体调控机制，还需要进一步的研究证实。

综上所述．miRNA-155的高表达对诊断恶性胸水具有一定的价值,miRNA-155高表达提示预后差，生存时间减少，其可能靶向TP53INP1基因参与肺癌的发生和发展过程中发挥重要作用，下调miRNA-155表达可抑制肺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，有可能成为肺癌治疗的靶基因。