恒温扩增芯片法对儿童大叶性肺炎病原学检测的临床研究

卢红霞 黄晗 梁利红 吴琳琳 王蕊

据统计，社区获得性肺炎是<5岁儿童死亡的主要原因，在我国居儿童死亡原因的首位[1]。大叶性肺炎是临床常见的获得性肺炎，多发于儿童群体，具有起病急骤、病程较长等特点，对患儿健康及生命安全造成极大威胁[2]。临床实践证实，明确病原菌类型对合理用药至关重要[3]。且有资料显示，尽早根据病原学检测结果采取针对性抗生素治疗能降低住院率及30天内死亡率[4]。而传统细菌培养虽可检出病原菌，但耗时较长、干扰因素较多，可能导致错失最佳治疗时机，影响疾病转归。恒温扩增芯片法是一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)原理的检测方法，从标本处理到报告结果全过程仅需2 h，检测周期明显缩短[5]。为此，本研究尝试分析恒温扩增芯片法对儿童大叶性肺炎病原学检测的临床价值，旨在为临床诊治提供更多途径。现报告如下。

资料与方法

一、一般资料

选择2017年10月～2018年10月我院收治的大叶性肺炎患儿500例作为研究对象，其中女182例，男318例，年龄1～10岁，平均年龄(6.23±1.80)岁，病情程度：轻症290例，重症210例。本研究经我院委员伦理委员会审批通过。

二、选取标准

1 纳入标准

均确诊为儿童大叶性肺炎，且符合《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)(上)》中儿童大叶性肺炎相关诊断标准[6]；入院前病程<1周，未接受抗生素等正规治疗；患儿均具备纤支镜术适应证；血常规、凝血时间、凝血酶原时间、肝功能、心电图等检查正常；患儿监护人均知情同意本研究方案，并签订支气管肺泡灌洗术、纤支镜术同意书；临床资料完整。

2 排除标准

伴有肝肾功能障碍者；合并心功能不全者；伴有其他感染性疾病者；存在肺结核、支气管哮喘等其他肺部疾病者；临床资料缺失者；参与本研究前服用抗生素、免疫抑制剂者。

三、方法

所有患者均于明确病原菌后给予针对性抗生素治疗。

1 仪器设备与材料

支气管肺泡灌洗采用购自日本olympus公司的支气管纤维镜，型号为Olympus BF-XP60型(外径：2.8 mm；内径：1.2 mm)、BF-1ci3C40(外径：3.6 mm；内径：1.2 mm)、BF-MP60(外径：4.0 mm；内径：2.2 mm)；上海赖氏电子科技有限公司的荧光显微镜(olympuscx21型)；博奥生物有限公司的离心机、恒温振荡器(SmartMixerTM24型)及晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；ELMI公司的混悬振荡器；海尔公司的冰箱(BCD-235F/T型)；法国Gilson公司的加样器；美国Axygen公司的Eppendor管；法国生物梅里埃公司的VITEK2 compact全自动细菌分析仪。

2 标本采集方法

所有操作均严格按照无菌操作要求执行，完善术前准备，选择合适镜条，经鼻腔插入，行气道局部麻醉，插入过程中仔细观察气管，尤其是病变部位；拍照后，推注5 mL生理盐水(37℃)，灌洗后吸出灌洗液，中间不停顿，重复3次，立即将收集的灌洗液装入涂硅灭菌玻璃容器或硅塑瓶，密封保存，置于含有冰块的保温瓶中，送往实验室，分装置入-80℃冰箱内冻存，剩余部分标本按常规操作规程行实验室检查。

3 常规培养检测法 参照《全国临床检验操作规程》进行检测，消毒无菌接种环，冷却后蘸取标本，分别接种于中国蓝平板、血琼脂平板、巧克力琼脂平板，置于培养箱孵化18～24 h，中国蓝平板置入普通培养箱，血琼脂、巧克力平板置入含有5%～10%二氧化碳的培养箱；24 h后观察培养平板内菌落生长情况，并准确记录，初步判断微生物数量；取培养出的主要微生物种类的单个菌落行革兰染色，根据染色结果行下一步鉴定，将可疑菌落与氯化钠溶液(浓度为0.45%)在PH值4.5～7.2范围内混匀，配成0.50～0.63 MCF的菌悬液，将VITEK2革兰氏阴性与阳性细菌鉴定卡的输样管插入到菌液中，按照顺序置于载卡架上，采用VITEK2 compact全自动细菌分析仪进行检测。

4 LAMP检测方法

根据GenBank公布的病原菌相对保守段基因序列，通过BLAST、Align X和Primer5.0程序选择并设计13种下呼吸道感染常见病原体的6条引物，其中包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)及两条环结合引物(FL、BL)(见表1)。引物序列由北京博奥生物有限公司合成(即为所检测的13种病原菌)，以每管20ul 分装后于-20℃保存。

表1 LAMP引物设计

按照痰液标本液化、清洗、提取标本核酸、核酸检测的顺序进行检测，根据阳性外对照的已知拷贝数和出峰时间(Tp值)确定标准曲线，利用RTisochip-A分析软件校正Tp值后再运用Calculator软件计算检出标本细菌浓度(copies/mL)。结果判定：标本病原体浓度≥1×103copies/mL判定为感染，检出浓度<1×103copies/mL判定为定植病原体。

5 支原体检测方法

对采集的所有肺泡灌洗液标本进行支原体抗体、支原体支原体聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)的核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)检测，并以支原体PCR RNA检测结果为金标准，分析对比三种检测方法对支原体诊断敏感性、特异性。

四、疗效判定标准

(1)临床判定标准：根据症状、体征、实验室检查(白细胞计数、中性粒细胞百分比，炎症相关指标、血气分析等)及影像学检查结果分为好转、维持、加重。(2)LAMP检测判定标准：好转：原检出病原体消失或检测拷贝数下降幅度≤1个数量级为好转；维持：原检测病原体拷贝数下降或上升<1个数量级，或无变化；加重：原病原体拷贝上升≥1个数量级或检出新的病原体。

五、观察指标

(1)细菌培养结果。(2)LAMP检测结果。(3)细菌培养与LAMP检测一致性分析。(4)LAMP检测支原体诊断敏感性、特异性。(5)疗效评估。

六、统计学方法

应用SPSS 22.0 软件进行统计分析实验数据，等级资料采用Ridit检验，一致性分析采用Kappa检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、细菌培养结果

细菌培养，180例标本呈阳性，阳性率为36.00%，以鲍曼不动杆菌(47.78%)、铜绿假单胞菌(26.11%)为主(见表2)。

二、LAMP检测结果

LAMP检测，291例标本呈阳性，阳性率为58.20%，鲍曼不动杆菌(20.96%)、耐甲氧西林葡萄球菌(19.93%)、铜绿假单胞菌(12.03%)居于前三位(见表3)。

表2 细菌培养结果

表3 LAMP检测结果

典型病例：王某，男，年龄8岁，以发热伴咳嗽、伴胸闷、胸痛为主诉入院就诊，胸片或肺部CT检查显示肺野呈斑片状密度增高影，怀疑为肺部感染，经气管镜下采集气道分泌物，行LAMP检测，证实大肠埃希菌呈阳性，结合影像学检查结果，确诊为大叶性肺炎。

三、一致性分析

LAMP检测与细菌培养的阳性符合率为66.67%，经Kappa分析显示，LAMP检测与细菌培养的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌一致性较高(P<0.05)；其余病原菌Kappa值均<0.4，一致性欠佳(见表4)。

四、支原体诊断敏感性、特异性

支原体PCR RNA检测出35例肺炎支原体感染，以此为金标准。LAMP检测支原体诊断敏感性94.29%、特异性99.35%高于支原体抗体检测77.14%、90.11%(P<0.05)，且与支原体PCR RNA检测结果相当(见表5)。

表4 一致性分析

表5 支原体诊断敏感性、特异性

五、疗效评估

Ridit检验显示，LAMP检测疗效评估结果与临床疗效评估结果无明显差异(P>0.05)(见表6)。

表6 疗效评估(n=291)

讨 论

儿童大叶性肺炎是临床常见肺炎类型之一，流行病学调查显示，其发病率可达到0.4%～1.6%左右，需给予重视[7-8]。肺炎发病主要是由于病毒、细菌、衣原体、支原体等多种病原微生物感染而致，临床表现不一，仅依靠胸部X线检查及临床表现无法有效区分病原体类型[9-10]。而研究指出，明确病原学对合理治疗、降低死亡率尤为重要[11-12]。故需尽快建立更快速、敏感和准确的病原学诊断方法。

目前，细菌培养是临床诊断肺炎感染病原菌的金标准，但其操作复杂、时间较长，无法达到在疾病早期快速诊断的目的，可能延误最佳治疗时机，影响病情转归及预后改善[13]。刘志远等[14]研究中对94例合格痰标本采用恒温扩增芯片法、细菌培养进行病原学检测，前者检出63株病原菌，后者检出10株病原菌。本研究发现，LAMP检测出13种病原体，远远超过细菌培养所检出的7种病原菌，与上述研究结果相符，提示LAMP检测可显著提高病原体检出率，存在明显优势。LAMP是一种新型分子生物诊断技术，主要依赖于特异的外部引物与内部引物对靶基因6个特定区域进行识别，同时利用具备链置换特性的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶，于等温条件下实现恒温快速扩增，不仅能从微量拷贝中获得目的基因，从而促使检出率明显上升，还具有操作简便、费用低廉、扩增反应快等优势，为快速检验病原学提供新途径[15-17]。同时，LAMP检测时设定有Tp值，在一定时间内扩增拷贝数达到一定数量才可判定为阳性，可有效区分定植菌与致病菌，从而避免将所有能检测到病原体DNA的标本都判断为阳性，减少假阳性发生[18]。且在大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等儿童大叶性肺炎主要致病菌方面，经Kappa分析，LAMP检测与细菌培养一致性较高，证实LAMP检测与细菌培养，在检出主要病原体方面具有较高一致性。但LAMP与细菌培养的总体阳性符合率仅为66.67%，主要是由于细菌培养检出病原菌类型少，假阴性现象严重，而LAMP检测检出嗜肺军团菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群、金黄色葡萄球菌等病原体，故导致两者阳性符合率欠佳。提示临床在检测小儿大叶性肺炎病原体时可优先选择恒温扩增芯片法，既可显著提高病原体检出率，还可缩短检验周期，快速明确病原学种类，有利于及时采取针对性抗生素治疗，一定程度上降低死亡风险。

肺炎支原体属于常见肺炎病原体，严重影响患儿生命健康[19]。临床多通过支原体抗体检测明确其感染情况，但干扰因素较多、诊断敏感性欠佳。支原体PCR RNA检测为肺炎支原体诊断金标准，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点，但对环境及仪器设备要求较高，无法区分定植菌和致病菌，亦不能进行药敏试验[20-21]。本研究表明，LAMP检测支原体诊断敏感性为94.29%、特异性为99.35%，显著高于支原体抗体检测，且与支原体PCR RNA检测结果相当，说明LAMP检测可作为临床检测肺炎支原体感染的首选方法。推测原因，LAMP检测过程中扩增产物大，易检测，从而提高诊断敏感性，同时要求4条特异性引物完全匹配靶基因6个不同位点，有利于保障高度特异性[22]。此外，在上述研究结果基础上，本研究进一步分析LAMP检测在疗效评估中的应用价值，发现其评估结果与临床依据症状、体征、实验室检查及影像学检查结果判定疗效无明显差异，可见其可以为临床判定疗效、合理调整治疗方案提供可靠信息，有利于促进病情转归。

综上可知，恒温扩增芯片法应用于儿童大叶性肺炎病原学检测中可同时检测出13种病原体，显著提高病原菌检出率，且对支原体诊断敏感性、特异性较高，有利于快速诊断、及时制定针对性治疗方案，还可为评估疗效提供参考依据。