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BIRC5高表达在胃癌中增强细胞活力、抑制凋亡并与预后不良相关*

2020-12-03李雪菲张丁丁董丹丹凌晨孙焕欣杜秋

中国病理生理杂志 2020年11期
关键词:免疫组化染色活力

李雪菲, 张丁丁, 董丹丹, 凌晨, 孙焕欣, 杜秋

BIRC5高表达在胃癌中增强细胞活力、抑制凋亡并与预后不良相关*

李雪菲1, 张丁丁2△, 董丹丹2, 凌晨3, 孙焕欣2, 杜秋1

(1成都中医药大学医学技术学院,四川 成都 610000;2四川省人民医院,四川 成都 610054;3电子科技大学,四川 成都 610000)

探讨含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列蛋白5 (BIRC5)在胃癌组织中的表达及其与胃癌患者预后的关系,并通过敲减表达探讨BIRC5对胃癌细胞活力和凋亡的影响。收集67例胃癌组织和癌旁组织,采用免疫组化检测BIRC5表达,并分析BIRC5表达与胃癌临床病理特征和预后的关系。采用RT-qPCR和Western blot检测胃癌细胞系AGS、MKN-1和MGC-803及正常胃上皮细胞系GES-1中BIRC5的mRNA和蛋白表达。将胃癌细胞系AGS分为blank组(不做任何处理)、Ctr-sh组(转染空白质粒)和BIRC5-sh组(转染BIRC5-shRNA质粒),用Western blot检测BIRC5-shRNA的干扰效率, MTT法检测各组细胞活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况, Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。BIRC5主要表达在细胞质中,胃癌组织中BIRC5阳性表达率高于癌旁组织(<0.01)。TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期及淋巴结转移的胃癌患者BIRC5阳性率分别高于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期及无淋巴结转移的胃癌患者(<0.05)。BIRC5阳性表达患者的生存期短于BIRC5阴性表达患者(=0.011 2)。在AGS细胞中敲减的表达,结果发现48、72和96 h的BIRC5-sh组细胞活力均低于相应时点的blank组和Ctr-sh组, BIRC5-sh组的细胞凋亡率高于blank组和Ctr-sh组, cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平高于blank组和Ctr-sh组, Bcl-2的蛋白表达低于blank组和Ctr-sh组(均<0.05)。胃癌中BIRC5高表达,这预示不良预后; BIRC5可以促进胃癌细胞生长,抑制细胞凋亡。

BIRC5蛋白;胃癌;细胞活力;细胞凋亡;预后

胃癌是一类起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,亦为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,常见于东亚地区及发展中国家,可达到全球胃癌发病率的67%[1-2]。绝大多数胃癌由于早期症状隐匿,常与胃炎和胃溃疡等胃慢性疾病混淆,当疾病进展至中晚期时才得以确诊,患者常因此失去最佳治疗时机,此时应用传统手术,放化疗治疗效果有限,生存率较低[3]。因此,探究胃癌的发病机制,寻找有效的治疗靶点对于提高胃癌病例的生存率至关重要。

含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列蛋白5 (baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5, BIRC5)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的成员,是抑制凋亡细胞死亡的负调节蛋白,可调节细胞有丝分裂,抑制caspase-3和caspase-7的活性,最终发挥抑制肿瘤细胞凋亡和促进细胞增殖的作用[4-5]。借助BIRC5在肿瘤组织中特异性高表达的特点及其强大的抗细胞凋亡作用,或许能够找到有效治疗胃癌的靶点药物。

本研究首先通过免疫组化检测胃癌组织及其相应癌旁组织中BIRC5表达量,分析其表达与胃癌临床病理特征及预后间的关系,随后利用RT-qPCR和Western blot法检测多种胃癌细胞系和正常胃上皮细胞系中BIRC5的mRNA和蛋白表达量,最后通过shRNA敲减技术、Western blot、MTT法及流式细胞术探究BIRC5对胃癌细胞活力和凋亡的影响,以期揭示BIRC5在胃癌细胞中的表达及其生物学功能,为胃癌靶向药物的研发提供理论指导。

材料和方法

1 样本资料

收集2014年2月~2015年2月入住我院行手术治疗的胃癌患者的胃癌组织及相应的癌旁组织(将距肿瘤边缘>5 cm的组织定义为癌旁组织)标本。要求患者未合并其他肿瘤或患有影响生命的重大疾病,且采样前未进行包括放疗、化疗、免疫治疗等在内的任何其他治疗,经病理诊断为胃癌,并且具有完整的病历和随访资料,最终入组67例。67例标本中,按年龄可分为34例60岁(含)以上患者和33例60岁以下患者;按性别则有男性患者45例,女性患者22例;按肿瘤分化程度,有35例呈中高分化程度,32例呈低分化表现; 54例为腺癌,13例为非腺癌; 20例TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期,47例为Ⅲ~Ⅳ期; 23例肿瘤最大径≥5 cm, 44例肿瘤最大径<5 cm; 31例可见淋巴结转移, 36例未见淋巴结转移; 58例患者均合并不同程度的胃炎。本研究所收集的67例患者标本均经由患者及患者家属签署知情同意书并遵循伦理委员会制定的伦理标准。

2 细胞及主要试剂

3株人源胃癌细胞系(AGS、MKN-1和MGC-803)和正常胃上皮细胞系GES-1均购自上海中国科学院细胞库。DMEM培养基、RPIM-1640培养基、F12K培养基、10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、双抗等细胞培养试剂购自Gibco; RNA提取试剂盒和RT-qPCR试剂盒等购自QIAGEN;实时荧光定量PCR仪购自BIO-RAD;转染试剂Lipofectamine 3000购自TaKaRa; MTT试剂盒购自奥淇洛谱生物科技有限公司; Annexin V-FITC试剂盒购自Sigma;兔源抗BIRC5单抗购自RD;细胞裂解液和HRP标记的羊抗兔II抗购自碧云天公司。BIRC5引物、内参照引物及BIRC5-shRNA由上海生工生物工程有限公司设计合成。

3 方法

3.1引物设计、RNA提取及RT-qPCR设计合成BIRC5的上游引物序列为5'-ATGGGTGCCCCGACGT-3',下游引物序列为5'-ACAGCAGTGAGTCTGTC-3';内参照β-actin的上游引物序列为5'-CTGACAGACTACCTCATGAAG-3',下游引物序列为5'-TCAATCCATGGCAGC-3';BIRC5-shRNA的序列为5'-GAAAGTGCGCCGTGCCATC-3'。

参照miRNeasy Mini Kit说明书提取总RNA。使用Invitrogen的SuperScriptTMII First-Strand Synthesis System将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增,反应程序为: 95℃ 2 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环。参照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书进行实验确定样品循环阈值(Ct值),检测BIRC5在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况。

3.2细胞的培养和转染AGS细胞用F12K培养基+10% FBS培养;MKN-1和MGC-803细胞用RPMI-1640培养基+10% FBS培养; GES-1细胞用DMEM培养基+10% FBS培养。

收集生长至对数期的细胞并接种于6孔板中,接种密度以80%为宜。参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书,将50 μg BIRC5-sh质粒或Ctr-sh质粒转染至细胞中,同时设立空白对照(blank)组,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。转染6 h后更换为正常含有10% FBS的完全培养液培养。采用Western blot检测BIRC5蛋白表达以验证转染效率。

3.3免疫组化染色将收集的胃癌组织及对应的癌旁组织标本经过甲醛固定48 h后常规制作切片,进行BIRC5蛋白抗原免疫组化检测。免疫组化抗原修复时间为8 min,封闭条件为室温封闭30 min,Ⅰ抗为兔源抗BIRC5单克隆抗体(1∶40稀释), 4℃孵育过夜。在切片的阳性细胞区域随机选择5个视野,在显微镜下对染色进行如下评分:(1)染色深浅按无着色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)和棕褐色(3分)评分;(2)染色细胞数量按没有细胞染色(0分)、1%~10%细胞染色(1分)、11%~33%细胞染色(2分)、34%~66%染色(3分)和超过66%染色(4分)评分。两项结果相加, <4分为阴性, ≥4分判断为阳性[4-5]。

3.4Western blot实验首先配制细胞裂解液于1.5 mL离心管中,置于冰上待用。预冷的PBS洗涤待收取细胞样品2次,加入裂解液后用细胞刮轻轻刮取细胞,收集细胞至1.5 mL离心管中,冰浴30 min,超声裂解仪瞬时超声破碎(功率35 W,超声3 s,停2 s,总时间10 min), 12 000 r/min离心10 min,收集上清并测定蛋白浓度。取100 μL上清液加入20 μL 6× protein loading buffer,沸水浴10 min后直接跑胶。分别配制12%分离胶和5%浓缩胶, 65 V恒压电泳30 min,使蛋白样品在浓缩胶中充分浓缩,待进入分离胶后,120 V电泳2 h。恒流250 mA转印60 min,转印结束后PBST漂洗3次,浸于5%脱脂乳中室温封闭1 h。PBST漂洗3次,加入Ⅰ抗稀释液稀释好的兔源抗BIRC5单克隆抗体, 4℃孵育过夜。回收Ⅰ抗, PBST漂洗3次,加入5%脱脂乳稀释的Ⅱ抗,室温震荡孵育1 h。PBST漂洗每次3次,加入显色液显色后置于曝光仪中曝光保存图片分析结果。

Western blot检测cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2等凋亡相关蛋白水平的方法同上,Ⅰ抗更换成抗相应蛋白的抗体。

3.5MTT实验检测细胞活力收集转染2 d后BIRC5-sh组、Ctr-sh组及blank组细胞,制备密度为2×107/L的细胞悬液,将细胞悬液接种于96孔板中,每孔100 μL,每组细胞铺3个板,分别测定24、48、72和96 h后的490值,每孔设置3个重复。每孔加入10 μL MTT工作液后置于37℃培养箱中孵育3 h,加入10 μL MTT溶解液后置于低俗摇床上震荡15 min,酶标仪检测各孔490值,记录分析数据。

3.6流式细胞术检测细胞凋亡待6孔板中细胞生长至70%时,胰酶消化细胞,制备细胞悬液并计数。取5×104个重悬细胞, 300×离心5 min,弃上清液,加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀。室温避光孵育10 min, 300×离心5 min,加入190 μL Annexin V-FITC结合液后重悬细胞,最后加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液混匀,冰浴避光后置于流式细胞仪进行检测。

3.7随访随访期间记录病例复发、死亡、删失情况及对应的时点,且每间隔3个月复查1次, 2年后每间隔6个月复查1次,直至患者死亡,记录患者的总生存期(overall survival, OS), OS的终点事件为任何原因引起的死亡。随访终止时间为2020年2月。

4 统计学处理

应用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,组间均数比较采用单因素方差分析;计数资料的检验方法为2检验;生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。当<0.05时认为差异有统计学意义。

结果

1 BIRC5在胃癌组织和细胞中高表达

免疫组化结果显示, BIRC5主要表达在细胞质中,颜色呈棕黄色,见图1;在胃癌组织中, BIRC5阳性表达率高于癌旁组织(<0.01),见表1。

Figure 1. Expression of BIRC5 in gastric cancer and paracancerous tissues (immunohistochemistry, ×200).

表1 胃癌组织和癌旁组织中BIRC5阳性表达率的比较

2 BIRC5表达与胃癌临床病理特征的关系

TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期及淋巴结转移胃癌患者的BIRC5阳性率高于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期及无淋巴结转移胃癌患者(<0.05);而不同年龄、性别、分化程度、组织学类型和肿瘤最大径的胃癌患者间BIRC5阳性率差异无统计学显著性(>0.05),见表2。

表2 BIRC5表达与胃癌临床病理特征的关系

3 BIRC5表达与胃癌预后的关系

根据随访患者的总生存期,绘制Kaplan-Meier生存曲线,并用log-rank检验比较BIRC5阳性表达的54例患者与BIRC5阴性表达的13例患者生存期差异,结果发现,BIRC5阳性表达患者生存期短于BIRC5阴性表达患者(=0.011 2),见图2。

Figure 2. Survival curves of gastric cancer patients with positive and negative expression of BIRC5.

4 敲减BIRC5表达抑制胃癌细胞活力

首先检测胃癌细胞系AGS、MKN-1和MGC-803及正常胃上皮细胞系GES-1中BIRC5的mRNA和蛋白表达,结果发现胃癌细胞中BIRC5的mRNA和蛋白表达均高于正常胃上皮细胞(<0.05),见图3A、B。在AGS细胞中敲减的表达, Western blot检测敲减有效(<0.05),见图3C; MTT法检测各组细胞活力,结果发现在48、72和96 h, BIRC5-sh组细胞活力均低于相应时点的blank组和Ctr-sh组(<0.05),见图3D。

Figure 3. Knock-down of BIRC5 inhibited the viability of gastric cancer cells. A: RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of BIRC5 in AGS, MKN-1, MGC-803 and GES-1 cells; B: Western blot was used to detect the protein expression of BIRC5 in AGS, MKN-1, MGC-803 and GES-1 cells; C: Western blot was used to detect the protein expression of BIRC5 in AGS cells to verify the knock-down efficiency; D: MTT assay was used to measure the viability of AGS cells in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs GES-1cells; #P<0.05 vs blankgroup.

5 敲减BIRC5表达促进胃癌细胞凋亡

流式细胞术检测各组细胞凋亡,结果发现,BIRC5-sh组的细胞凋亡率高于blank组和Ctr-sh组(<0.05),见图4A。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平,结果发现BIRC5-sh组的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平高于blank组和Ctr-sh组,而Bcl-2的蛋白表达低于blank组和Ctr-sh组(<0.05),见图4B。

Figure 4. Knock-down of BIRC5 expression promoted the apoptosis of gastric cancer AGS cells. A: flow cytometry analysis; B: Westeren blot analysis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank group.

讨论

胃癌是一种常见的消化系统肿瘤,由于具有发病初期症状隐匿的特点,常被患者忽视,从而错过最佳治疗时机,严重影响该病的治愈率和生存期。尽管近年来有多种胃癌靶向治疗方法的相关研究,但总体疗效并不理想。因此,从分子学角度探究胃癌的发生发展机制,寻找有效的治疗靶点对胃癌的临床治疗有非常重要的意义。

细胞凋亡对于维持机体细胞的正常功能具有非常重要的作用。正常情况下,机体可通过启动凋亡程序清除受损的DNA或循环周期异常的细胞。但是,当细胞发生恶变时,凋亡机制受损,机体不能主动清除恶变细胞,最终导致肿瘤发生及产生耐药性。IAP是一类进化高度保守的抗细胞凋亡因子,主要通过抑制caspase活性及调节NF-κB的作用而抑制细胞凋亡。作为基因家族最小的成员,全长14.7 kb,位于染色体17q25,于1997年从人类基因组库中筛选分离鉴定得出[6]。BIRC5具有多种生物学功能:(1)在抑制细胞凋亡方面效果显著:目前的研究表明, BIRC5可通过多种途径直接或间接抑制caspase-3和caspase-7的活性,最终阻止细胞凋亡[7];(2)促进细胞有丝分裂: BIRC5羧基末端的α螺旋结构可协助校准有丝分裂中期的染色体分裂过程及有丝分裂早期的微管运动;(3)促进血管生成;(4)作为肿瘤诊断、治疗及预后判断的生物标志物[8]。因此,抑制BIRC5的活性,或有助于抑制肿瘤细胞的增殖与转移,提示BIRC5可能成为肿瘤治疗的潜在新靶点。

BIRC5在多种肿瘤组织中高表达,如鼻咽癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等,而在正常组织表达量很低或不表达[7, 9-12],已证实BIRC5参与肿瘤细胞的恶变及抗细胞凋亡生理过程,提示BIRC5可以作为抗肿瘤治疗的一个重要靶点。在本研究中,通过对67例胃癌患者的胃癌组织样本进行免疫组化染色发现,胃癌组织中的BIRC5阳性表达率显著高于癌旁组织,说明BIRC5的高表达与胃癌的发生存在正相关[13];同时, Zou等[14]的研究发现,该项指标可作为胃癌患者肿瘤复发的独立预后因子。之后,我们将BIRC5的表达与肿瘤的临床病理特征进行对比发现,BIRC5高表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及患者OS具有显著相关性,该结论与Krieg等[15]通过收集20个研究中共2 695名胃癌患者的临床病理信息进行数据分析所得的结论一致,说明BIRC5的高表达与胃癌患者预后不良具有一定相关性。为了探究BIRC5与肿瘤增殖及凋亡的关系,本实验通过敲减的表达,检测到BIRC5-sh组的细胞活力低于blank组和Ctr-sh组,而细胞凋亡率高于blank组和Ctr-sh组,结合细胞凋亡蛋白表达的变化,表明BIRC5的激活可具有增强胃癌细胞活力、抑制细胞凋亡的作用。据报道, BIRC5的表达与胃癌的血管形成具有密切关系,提示BIRC5促进胃癌发生的作用机制可能与其促进肿瘤新生血管生成作用机制相关: BIRC5表达上调后抑制血管内皮细胞凋亡,分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),促进微血管生成,为肿瘤细胞快速生长提供营养物质;与此同时,VEGF也可反馈促进BIRC5的表达上调,二者协同促进肿瘤的快速发展[16-17]。但本研究并未揭示BIRC5在胃癌组织中异常表达的调控机制,仍需进一步研究以确定BIRC5确切的调控及作用机制,以改善胃癌的诊疗现状。

综上所述,本研究证实BIRC5在胃癌组织中的高表达可增强细胞活力,抑制细胞凋亡;高表达BIRC5的胃癌患者相较于低表达BIRC5的患者预后更差。因此,BIRC5的表达程度可作为判断胃癌患者预后的指标之一,同时抑制BIRC5的活性在未来可能成为胃癌靶向治疗的新方向。

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High expression of BIRC5 enhances cell viability, inhibits apoptosis and is associated with poor prognosis in gastric cancer

LI Xue-fei1, ZHANG Ding-ding2, DONG Dan-dan2, LING Chen3, SUN Huan-xin2, DU Qiu1

(1,,610000,;2,610054,;3,610000,)

To investigate the expression of baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5 (BIRC5) in gastric cancer tissue and its relationship with prognosis of gastric cancer patients, and to explore the effect ofknock-down on the viability and apoptosis of gastric cancer cells.The expression of BIRC5 was detected by immunohistochemistry in 67 cases of gastric cancer tissues and paracancerous tissues for analyzing the relationships with clinicopathological characteristics. The mRNA and protein expression levels of BIRC5 in gastric carcinoma cell lines (AGS, MKN-1 and MGC-803) and normal gastric epithelial cell line GES-1 were detected by RT-qPCR and Western blot. The AGS cells were divided into blank group (no treatment), Ctr-sh group (blank plasmid transfection) and BIRC5-sh group (BIRC5-shRNA plasmid transfection). The interference efficiency of BIRC5-shRNA was evaluated by Western blot. The cell viability was measured by MTT assay, the apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the levels of apoptosis-related proteins cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 were determined by Western blot.BIRC5 was mainly expressed in cytoplasm, and the positive expression rate of BIRC5 in the gastric cancer tissues was higher than that in the adjacent tissues (<0.01). The positive rates of BIRC5 in the gastric cancer patients at TNM Ⅲ~Ⅳ stages and with lymph node metastasis were higher than those in the patients at TNM Ⅰ~Ⅱ stages and without lymph node metastasis, respectively (<0.05). The survival time of the patients with positive BIRC5 expression was shorter than that of the patients with negative BIRC5 expression (=0.011 2). The cell viability in BIRC5-sh group was lower than that in blank group and Ctr-sh group at time points of 48, 72 and 96 h. The apoptotic rate in BIRC5-sh group was increased compared with blank group and Ctr-sh group. The protein levels of cleaved caspase-3 and Bax in BIRC5-sh group were higher than those in blank group and Ctr-sh group, while the protein expression of Bcl-2 in BIRC5-sh group was lower than that in blank group and Ctr-sh group (<0.05).High expression of BIRC5 in gastric cancer indicates poor prognosis. BIRC5 promotes the growth of gastric cancer cells and inhibits apoptosis.

BIRC5 protein; Gastric cancer; Cell viability; Apoptosis; Prognosis

R735.2; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.013

1000-4718(2020)11-2013-07

2020-04-24

2020-07-09

2016年四川省卫生和计划生育委员会科研课题(No.16PJ019)

Tel: 18782982083; E-mail: lynnlclc@163.com

(责任编辑:余小慧,罗森)

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