基于CaCC的P2ry2调节剂细胞筛选模型的建立及应用*

郭佳琦， 肖云萍， 丁旭， 解宇浩， 张嘉琪， 郝峰△

·实验技术·

基于CaCC的P2ry2调节剂细胞筛选模型的建立及应用*

郭佳琦1， 肖云萍2， 丁旭1， 解宇浩1， 张嘉琪1， 郝峰1△

（1吉林医药学院检验学院，2北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132031）

构建基于钙激活氯离子通道（CaCC）的高通量P2Y2嘌呤受体（P2ry2）调节剂细胞筛选模型。采用RT-PCR方法验证Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮细胞（FRT细胞）中P2ry2的mRNA 表达水平，切胶回收PCR扩增产物并进行序列测序和比对，进一步应用Western blot检测FRT细胞的P2ry2蛋白表达水平。构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体，应用脂质体转染、抗生素筛选和有限稀释，获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。采用倒置荧光显微镜观察共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞的情况，并应用荧光淬灭动力学实验验证模型的有效性；荧光淬灭动力学实验验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂，并应用Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内游离钙的变化，探究胞内Ca2+浓度与P2ry2调节剂的剂量依赖关系；用Z'因子评价本模型的稳定性和可重复性。FRT细胞内源性表达P2ry2；倒置荧光显微镜中观察到ANO1在细胞膜上表达绿色荧光，YFP-H148Q/I152L在胞浆中表达绿色荧光，成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的细胞模型；荧光淬灭动力学实验证实该细胞模型可筛选P2ry2调节剂，应用Fura-2表明该细胞模型可敏感地检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca2+浓度与P2ry2调节剂及相对荧光强度呈剂量依赖关系；Z'因子为0.75，说明该细胞模型可以高通量筛选P2ry2的调节剂且有良好的稳定性与可重复性。成功构建了一种经济简便快捷高效的P2ry2调节剂细胞筛选模型，适用于P2ry2调节剂的发现与评价。

P2Y2嘌呤受体；钙激活氯离子通道；高通量筛选；FRT细胞

P2Y嘌呤受体（P2Y purinergic receptors， P2rys）是一类由胞外核苷酸活化的G蛋白偶联受体，目前已经从人体组织细胞中克隆了7个P2ry亚单位：P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14，其中P2ry2作为P2ry的一个重要亚型，日益受到人们的重视。P2ry2广泛分布在脾、睾丸、肾、肺、心脏和大脑中，与诸多生理功能密切相关，如冠状动脉平滑肌收缩、慢性支气管炎、动脉粥样硬化、囊性纤维化和对肿瘤的治疗等。因此P2ry2的调节剂在疾病治疗中发挥重要作用， UTP作为P2ry2天然的激动剂可以介导小鼠冠状动脉收缩［1］；地夸磷索是P2ry2激动剂在治疗干眼病中的常用药物［2］；激活P2ry2在治疗胃食管反流病、乳腺癌及心肌缺血［3-5］等疾病方面也有潜在的作用；其拮抗剂可以治疗特发性肺纤维化，改善卵母细胞的发育能力，抑制炎症反应等［6-8］。P2ry2在许多病理条件下显示出可塑性，可能是治疗这些疾病的潜在靶标。由于P2Y受体亚型重叠表达，目前发现的激活剂和拮抗剂大多数作用于P2Y受体，缺少P2ry2高特异性、高亲和力的受体激动剂和拮抗剂。

近年来检测细胞内游离Ca2+浓度常用Fura-2等Ca2+指示剂［9］，这种方法虽然相对简便，但荧光染料易累积在细胞的酸性细胞器中（称为隔室效应或分室效应），不与胞浆内游离Ca2+结合，会导致测量上的误差。膜片钳技术与荧光测钙技术结合的光电联合检测技术可以解决以上问题，是运用多种方法多方面研究生物现象的典范，但是这种方法缺点是操作复杂且重复性差。

黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein， YFP）可在细胞内长久表达，其相对荧光强度高，重复性好。YFP-H148Q/I152L是对卤族元素敏感YFP的双突变体，已被用作表达钠碘转运体内源性或外源性细胞内I-积累的基因编码生物传感器，可敏感反应钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channel， CaCC）的开放。本文报道本实验室构建的共表达钙激活氯离子通道ANO1和YFP-H148Q/I152L的细胞模型，其原理基于CaCC功能［10］，当P2ry2与其激动剂结合后，通过信号通路使细胞内的滑面内质网释放Ca2+，进而使ANO1开放，胞内Cl-与胞外I-交换，引起细胞内YFP淬灭。该细胞模型可敏感地检测细胞内Ca2+变化，且可反复传代、重复性好、经济、高效，为高通量筛选P2ry2调节剂及研究其生理病理功能等方面提供了良好的基础。

材料和方法

1　主要仪器

PCR仪（ABI）；电泳仪和ChemiDoc凝胶成像仪（Bio-Rad）；倒置荧光显微镜（Nikon）； Fluo Star多功能酶标仪（BMG）。

2　细胞和主要试剂

Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮细胞（Fischer rat thyroid cells， FRT细胞）由中国科学院应用化学研究所关新刚教授馈赠。RT-PCR试剂盒购自南京诺唯赞公司；PCR试剂盒和DNA Marker购自全式金公司；琼脂糖购自Oxoid； RIPA和DAB显色液购自碧云天公司；兔抗大鼠P2ry2多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin单克隆抗体和山羊抗兔IgG购自Abcam； Lipofectamine 3000脂质体、Zeocin抗生素和G418抗生素购自Invitrogen； Fura-2/AM、P2ry2激动剂ATP、UTP、ADP，P2ry2拮抗剂suramin、PPADS，ANO1激动剂Eact和ANO1抑制剂NFA购自Sigma；引物由金唯智公司合成，见表1。

表1　RT-PCR引物序列

3　方法

3.1RT-PCR法检测 P2ry2的mRNA表达设计P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14的引物，选择生长状态良好的FRT细胞株，加入Trizol，按照说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR，反应条件为： 94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 2 min， 30个循环； 72℃再延伸5 min；最终降至4℃。所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

3.2PCR产物切胶回收测序待凝胶尚未干燥时，用干净的手术刀片切取含有目的条带的凝胶，要使切下的凝胶条尽可能细，用小镊子移入0.5 mL EP管内并称重；加入3~5倍的溶胶液，50℃水浴5~10 min，保证胶块充分溶解，将所得溶液放入吸附柱中，8 000×离心30 s后倒掉废液；向吸附柱中加入2次漂洗液，9 000×离心30 s后倒掉废液，并将空吸附柱离心，尽量除尽漂洗液；将吸附柱彻底晾干，放入干净的EP管中，向吸附膜中间位置加入适量双蒸水，离心1 min后收集DNA溶液；将所得DNA溶液送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

3.3Western blot 法检测细胞P2ry2的蛋白表达取生长状态良好的FRT细胞，经RIPA裂解液裂解后，提取细胞总蛋白。经SDS-PAGE分离蛋白，转膜、封闭后分别孵育Ⅰ抗，4℃孵育过夜。P2ry2兔抗鼠多克隆抗体稀释比例为1∶100；β-actin单克隆抗体稀释比例为1∶500。次日，经洗膜后分别孵育Ⅱ抗，比例为1∶200，常温孵育1 h，再经洗膜后应用化学发光法检测抗原抗体结合区条带。

3.4ANO1和YFP-H148Q/I152L真核表达载体的构建提前16 h左右消化FRT细胞，使细胞密度在转染时可达到70%~80%，按照Lipofectamine 3000说明书，将ANO1转染到FRT细胞中，48 h后倒置荧光显微镜观察细胞膜上可见绿色荧光，Zeocin抗生素筛选，2周后划掉阴性细胞并挑选合适的单细胞克隆团，在96 孔细胞培养板中扩大培养，经2次有限稀释后获得阳性克隆细胞株，连续2次传代观察细胞膜上全部表达绿色荧光为稳定表达ANO1的阳性细胞株，进行扩大培养。将YFP-H148Q/I152L转染到已表达ANO1的FRT细胞中，倒置荧光显微镜下观察胞浆可见绿色荧光信号，G418抗生素筛选，具体步骤同上，获得ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达的FRT细胞株。

3.5荧光淬灭动力学实验验证细胞模型构建有效性将构建好的细胞模型铺于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100 μL完全培养液，培养2~3 d后，用酶标仪进行检测。设置1组对照组和2组实验组，每组设计3个复孔。对照（control）组用100 μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50 μL的不加钙镁PBS，泵内加入碘离子PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组1 （experimental group 1）用100 μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50 μL的ANO1激动剂Eact （100 μmol/L），泵内加入碘化钠PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组2 （experimental group 2）用100 μL不加钙镁PBS洗3次，每孔加入50 μL的ANO1拮抗剂NFA（300 μmol/L），孵育10 min，吸出NFA，加入50 μL的Eact （100 μmol/L），泵内加入碘化钠PBS缓冲液，记录荧光淬灭情况。具体设置如下：激发光波长500 nm，发射光波长540 nm。以每秒5个点的速度动态检测相对荧光强度，其中前2 s为基线，2 s后以280 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL碘离子PBS缓冲液。

3.6荧光淬灭动力学实验验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂将构建好的细胞模型铺于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100 μL完全培养液，培养2~3 d后，用酶标仪进行检测。设置1组对照组和2组实验组，每组设计3个复孔。对照组用100 μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50 μL的不加钙镁PBS，泵内加入碘离子PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组1用100 μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50 μL的P2ry2激动剂ATP （300 μmol/L），泵内加入碘化钠PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组2 用100 μL不加钙镁PBS洗3次，每孔加入50 μL的P2ry2拮抗剂suramin （1 000 μmol/L），孵育10 min，吸出suramin，加入50 μL的ATP （300 μmol/L），泵内加入碘化钠PBS缓冲液，记录荧光淬灭情况。具体设置同上。

3.7Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内钙离子浓度的变化当细胞融合至适宜密度时，用0.25%胰蛋白酶和 0.02% EDTA 混合液消化细胞，然后用DMEM 液终止消化并制成细胞悬液，离心收集细胞。取细胞悬液37℃预温5 min，加入终浓度为5 μmol/L的Fura-2/AM， 37℃恒温避光孵育负载40 min，离心并弃上清液，用PBS清洗3次，最后用PBS重悬细胞，使用Fluo star多功能酶标仪检测ATP引起的细胞内钙离子浓度的变化，细胞内钙离子浓度以340 nm荧光强度与380 nm荧光强度（F340/F380）的比值来计算。

3.8细胞模型高通量筛选的评估首先将一个黑壁透明96孔板的6列加入300 μmol/L的ATP作为实验组，同时另外6列加入碘化钠PBS缓冲液作为阴性对照，检测96孔的Z'因子值。Z'因子只与实验的重复性与可靠性有关而与实验内容无关，因此是评估高通量筛选的一种重要指标。Z'值可根据以下公式计算：Z'=1-3×（SDsig+SDback）/（Msig-Mback），该公式中SD代表信号（sig）或背景（back）的标准差，M代表信号（sig）或背景（back）的平均值。一般Z'因子值在0.5~1时，说明高通量筛选模型稳定性高。

4　统计学处理

所有样本检测均重复3次以保证检测结果准确性。利用GraphPad Prism 5软件对对照组和实验组进行数据处理，所有样本不服从正态分布，采用秩和检验进行分析，统计学分析采用Mann-Whitney检验，以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　FRT细胞内源性表达P2ry2

RT-PCR结果显示，P2ry2和β-actin分别在365 bp和260 bp处出现特异性条带， P2ry1、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14均未扩增出特异性条带，见图1A，证明FRT细胞在mRNA水平上表达P2ry2。将PCR的产物切胶回收送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在Chromas软件上进行分析，并将所测核苷酸序列在NCBI-BLAST进行比对，与GenBank数据库收录的P2ry2的基因序列完全一致，见图1B、C，证明所克隆DNA片段即为目的基因片段。

Western blot结果显示， P2ry2可特异性表达，它和β-actin相对表达量均为42 kD，见图1D。这证明FRT细胞在蛋白水平上表达P2ry2。

Figure 1.　Confirmation of the endogenous expression of P2ry2 in FRT cells. A: RT-PCR verification of P2ry2 mRNA level; B: sequencing results of PCR products of P2ry2; C: comparison of P2ry2 sequencing results with P2ry2 gene sequence; D: Western blot verification of P2ry2 protein expression.

2　细胞模型构建原理及结果

当P2ry2与其激动剂结合后，通过信号通路使细胞内的滑面内质网释放Ca2+，进而使ANO1开放，胞内Cl-与胞外I-交换，引起细胞内YFP淬灭，见图2A。

FRT细胞膜上可见绿色荧光，结果显示ANO1表达在细胞膜上；FRT细胞胞浆内和膜上均可见绿色荧光证明YFP-H148Q/I152L表达在胞浆中，见图2 B、C。

Figure 2.　The principles and results of cell model construction. A: the principle of cell model detection; B: the expression of ANO1 in the FRT cells (×200); C: the expression of YFP-H148Q/I152L in the FRT-ANO1 cells (×200).

3　细胞模型有效性鉴定结果

荧光淬灭动力学实验结果显示，对照组只加入碘化钠PBS缓冲液，相对荧光强度无显著变化，说明ANO1未开放；实验组1 加入激动剂Eact后，相对荧光强度显著下降，说明ANO1开放；实验组2 加入拮抗剂NFA孵育10 min后，再加入激动剂Eact，相对荧光强度无明显变化，说明ANO1未开放。对照组与高纯激动剂组的差异有统计学显著性（<0.01），对照组与NFA+Eact组的差异无统计学显著性（>0.01），见图3。这证明我们成功构建了ANO1-YFP-H148Q/I152L细胞模型。

Figure 3.　Validation of cell model by fluorescence quenching kinetic test with ANO1 agonist Eact and ANO1 antagonist NFA.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group.

4　荧光淬灭动力学实验证细胞模型是否可筛选P2ry2调节剂

荧光淬灭动力学实验结果显示，对照组只加入碘化钠PBS缓冲液，相对荧光强度无显著变化，说明ANO1未开放；实验组1加入ATP后相对荧光强度显著下降，说明ANO1开放；实验组2加入拮抗剂suramin孵育10 min后，再加入激动剂ATP，相对荧光强度无明显变化，说明ANO1未开放。对照组与单纯激动剂组的差异有统计学显著性（<0.01）；对照组与surmain+ATP组的差异无统计学显著性（>0.01），见图4。证明所构建细胞模型可筛选P2ry2调节剂。

Figure 4.　Fluorescence quenching kinetics test was used to verify the cell model was able to screen P2ry2 regulator with p2ry2 agonist ATP and P2ry2 antagonist suramin.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

5　Fura-2/AM荧光探针法检测结果

加入不同浓度ATP后，结果表示ATP浓度越高，slope值越高，即荧光斜率值与ATP浓度呈剂量依赖关系；加入ATP后，细胞内Ca2+浓度瞬时升高，且随着ATP浓度的升高，Ca2+浓度越高，其浓度与ATP浓度呈剂量依赖关系。结果表明，Ca2+浓度与荧光斜率值成剂量依赖关系，见图5。证明该细胞模型可敏感检测细胞内Ca2+浓度的变化。

Figure 5.　Detection results of Fura-2 fluorescent probe method. A: dose-dependent relationship between fluorescence slope and ATP concentration; B: dose-dependent relationship between Ca2+ concentration and ATP concentration；C:relationship between Ca2+ concentration and fluorescence slope.

6　不同P2ry2调节剂与相对荧光强度的剂量关系

加入不同的激动剂后，检测到不同的荧光信号，激动剂浓度越高，相对荧光强度越大，结果表明激动剂浓度与相对荧光强度呈剂量依赖关系，其EC50分别为11.2、26.5和188.7 μmol/L，见图6A。加入含有激活剂的碘离子PBS缓冲液后，抑制剂浓度越高，相对荧光强度越小，即抑制剂浓度越大抑制作用越强，其IC50分别为35.1和135.6 μmol/L，见图6B。证明拮抗剂浓度与相对荧光强度呈剂量依赖关系。

Figure 6.　Dose-dependent curves of P2ry2 activator and inhibitor. A: the dose-dependent curves of P2ry2 activators; B: the dose-dependent curves of P2ry2 inhibitors.

7　Z'因子评估

通过对96孔数据分析和计算得到， SDsig=7， SDback=1， Msig=100， Mback=5， Z'=0.75，信噪比为17.48∶1，从Z'值和信噪比来看，模型可用于高通量筛选，且敏感性高，见图7。

Figure 7.　Z 'factor was applied to evaluate the stability and repeatability.

讨论

P2ry2作为P2ry重要的亚型，偶联于G蛋白——Gq/11，其信号通过PLC作用于细胞膜上的PIP2，使其水解为IP3和DG。IP3使内质网钙库释放Ca2+，同时激活PKC，进而使细胞内各种细胞因子磷酸化产生多种生理效应，如冠状动脉平滑肌收缩、慢性支气管炎、动脉粥样硬化、囊性纤维化和对肿瘤的治疗等［11］。P2ry2在痛觉的产生和调节中也起着重要的作用，并被认为是未来疼痛治疗的新靶点。目前常用的P2ry2激动剂有UTP、ATP、ADP及2-MeSATP等，拮抗剂主要有suramin及PPADS等。目前发现的激动剂对P2Y受体都有不同程度的激动作用，其中UTP因在人体组织中会快速代谢，而无法成为P2ry2相关疾病的治疗药物； suramin和PPADS均是P2Y受体的拮抗剂，其中PPADS对P2ry2的拮抗作用相对较弱。近年来发现的P2ry2调节剂几乎都作用于P2Y受体的其他亚型，缺乏P2ry2高度特异性、高亲和力的受体激动剂和拮抗剂，阻碍了对其功能及机制的研究。

目前常选用检测细胞内Ca2+浓度的方法来筛选P2ry2调节剂，检测细胞内Ca2+浓度方法有很多，如荧光染料探针技术，激光共聚焦显微技术，高分辨率数字成像显微技术，膜片钳技术与荧光测钙技术结合而成的光电联合检测技术等。这些方法存在耗时长，价格昂贵，操作复杂和重复性差等缺点。

因FRT内源性表达P2ry2，本实验室构建基于钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体的FRT细胞。实验结果表明，在加入ANO1的激动剂后，荧光信号强度显著下降，加入ANO1的抑制剂后，荧光信号强度无明显变化，说明成功构建ANO1-YFP-H148Q/I152L细胞模型；在加入P2ry2的激动剂后，荧光信号强度显著下降，加入P2ry2的抑制剂后，荧光信号强度无明显变化，说明本模型适用于P2ry2调节剂的筛选；细胞内Ca2+浓度与P2ry2激动剂和荧光斜率值成剂量依赖关系；Z'因子值为0.75，说明本模型适用于高通量筛选P2ry2激动剂和拮抗剂，为探究P2ry2功能和机制提供了良好的基础。

本模型为P2ry2调节剂的初筛模型，具体在应用上也会出现很多问题，以下因素可能会影响筛选结果：筛选到的激活剂可能作用于其他内源性表达的Ca2+通道；药物小分子进入细胞中，自己本身影响荧光淬灭，出现假阳性；有的化合物虽然抑制效果好，但不是直接作用于受体，而是使蛋白质变性，不是选择性抑制剂。尽管本模型有很多不足之处，但是本模型有简便、经济、稳定性好等优点，为高通量筛选提供了很好的解决方法。

本实验室构建的细胞模型为探究P2ry2功能和机制提供了良好的基础。此外还可应用于钙激活氯离子通道ANO1的调节剂筛选［12］，为后续深入研究钙激活氯离子的生理病理过程及钙激活氯离子通道调节剂的发现奠定了基础。

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Establishment and application of cell model for P2ry2 modulators screening based on CaCC

GUO Jia-qi1， XIAO Yun-ping2， DING Xu1， XIE Yu-hao1， ZHANG Jia-qi1， HAO Feng1

（1，，2，，132013，）

To construct a high-throughput screening cell model for P2Y2purinergic receptor （P2ry2） modulators based on calcium-activated chloride channel （CaCC）.The mRNA expression of P2ry2 in Fischer rat thyroid （FRT） cells was detected by RT-PCR， and the PCR products were collected and sequenced. The protein expression of P2ry2 in the FRT cells was also detected by Western blot. The eukaryotic expression vectors ANO1 and YFP-H148Q/I152L were constructed. The FRT cells co-expressing ANO1 and YFP-H148Q/I152L were obtained by liposome transfection， antibiotic screening and limited dilution. The expression of ANO1 and YFP-H148Q / I152L in the cells was observed under fluorescent inverted microscope. The validation of the cell model for screening P2ry2 modulators was verified by the fluorescence quenching kinetics tests， and intracellular free calcium was analyzed by Fura-2 staining to investigate the dose-dependent relationship between intracellular calcium concentration and P2ry2 modulators. Z' factor was applied to evaluate the stability and repeatability of the cell model.P2ry2 were endogenously expressed in the FRT cells. The expression of ANO1 on the cell membrane and the expression of YFP-H148Q/I152L in the cytoplasm were observed under fluorescent inverted microscope. The cell model was successfully constructed. The fluorescence quenching kinetics test confirmed the cell model for screening P2ry2 modulators was constructed successfully， and the calcium concentration in cytoplasm was increased rapidly after the addition of a small amount of P2ry2 agonist， indicating that the cell model was sensitive for detecting the calcium concentration in cytoplasm. The calcium concentration in cytoplasm， P2ry2 modulators and the slope of fluorescence change were in a dose-dependent manner， respectively. The Z' factor was 0.75， indicating that the established cell model was able to use for high-throughput screening of P2ry2 modulators with excellent stability and repeatability.A simple， economical， and efficient cell screening model of P2ry2 modulators is successfully constructed， which is suitable for the detection and evaluation of P2ry2 modulators.

P2Y2purinergic receptor； Calcium-activated chloride channel； High-throughput screening； FRT cells

R33-33； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.027

1000-4718（2020）11-2105-08

2020-03-17

2020-07-16

国家自然科学基金项目资助（No.81601234）；吉林省教育厅基金资助课题（No.JJKH20170418KJ; No. JJKH20191056KJ）；吉林医药学院启动资金（No.2017KYQD001）；吉林省卫生与健康技术创新项目（No.2018J113)；国家级和吉林省大学生创新创业训练计划（No.201713743004; No.201913706071）

Tel: 0432-64561069; E-mail: haof863@126.com

（责任编辑：宋延君，余小慧）