连续性肾脏替代治疗对急性肾损伤患者自噬相关蛋白表达及预后的影响

吕昕， 唐文学， 郭亮

连续性肾脏替代治疗对急性肾损伤患者自噬相关蛋白表达及预后的影响

吕昕， 唐文学△， 郭亮

（杭州师范大学附属医院重症医学科，浙江 杭州 310000）

探讨连续性肾脏替代治疗（CRRT）对急性肾损伤（AKI）患者自噬相关蛋白表达及预后的影响。选取2015年2月~2018年3月于杭州师范大学附属医院被诊断为AKI并接受CRRT的患者共计174例。比较CRRT治疗前后患者血浆白细胞介素1β （IL-1β）和白细胞介素6 （IL-6）蛋白水平及血单核细胞中微管相关蛋白1轻链3-II （LC3-II）、自噬相关蛋白5 （Atg5）和beclin-1的mRNA表达水平，并进一步分析上述分子的表达水平与患者血清肌酐（SCr）的相关性。根据治疗4周后的生存情况，将入选患者分为死亡组（=43）和生存组（=131），对两组患者上述指标的水平进行比较。CRRT后，患者外周血的IL-1β、IL-6和SCr水平均较治疗前显著下降（<0.05）， LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表达水平显著降低（<0.05）。死亡组患者LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表达水平显著高于生存组（<0.05）。IL-1β、IL-6、LC3-II和beclin-1的表达水平与SCr呈正相关（<0.05），然而Atg5的表达水平与SCr无显著相关性（>0.05）。CRRT能够降低AKI患者外周血自噬相关分子的mRNA表达水平，进而降低自噬水平，对AKI患者发挥保护性作用。自噬相关分子的mRNA可作为预测CRRT预后的重要指标。

急性肾损伤；连续性肾脏替代治疗；自噬；炎症因子；预后

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是重症监护病房常见的疾病，连续性肾脏替代治疗（continuous renal replacement therapy， CRRT）是目前临床上治疗AKI最常用且最为有效的治疗手段之一［1］。细胞自噬能够清除受损的细胞，但也能调控炎症因子，参与炎症反应，在AKI中发挥着重要的作用［2-3］。 CRRT能够有效清除患者血液中的炎症因子，但其对自噬活性的影响尚未被揭示，缺乏相关的实验研究。本次研究旨在探讨CRRT对AKI患者外周血自噬相关蛋白表达及预后的影响，进一步研究CRRT对AKI的保护机制。

材料和方法

1　一般资料

选取2015年2月~2018年3月在杭州师范大学附属医院被诊断为AKI并接受CRRT的患者共174例，引起AKI的原发病包括重症急性胰腺炎（49例）、脓毒血症（29例）、严重创伤及创伤术后（28例）、恶性肿瘤切除术后（20例）、骨科手术术后（9例）、心胸外科手术术后（24例）和脑出血术后（15例）。其中男性99例，女性75例，年龄26~75岁，平均（54.39±10.37）岁。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）符合国际改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease Improving Global Outcomes， KDIGO）公布的AKI诊断标准［4］；（3）无肾脏毒性药物服用史。排除标准：（1）在本次诊断前已接受CRRT；（2）患者或其代理人不同意参与本实验研究；（3）临床资料不完整；（4）合并肝硬化、自身免疫性疾病、抑郁症等疾病。所有患者均接受CRRT治疗，具体采用连续静脉-静脉血液滤过（continuous veno-venous hemofiltration， CVVH）模式。预冲液为0.9％氯化钠3 000 mL加入普通肝素100 mg，预冲时间30 min。血流速度控制在100～200 mL/min，治疗剂量不低于35 mL·kg-1·h-1。治疗4周内死亡（均因多脏器功能衰竭死亡）的患者共计43例，纳入死亡组，其余131例患者纳入生存组。死亡组中，男性27例，女性16例，平均年龄（55.04±9.48）岁，平均身高为（168.5±11.4） cm，平均体重为（63.4±6.4） kg，体重指数（body mass index， BMI）为（25.6±3.4） kg/m2， APACHE II评分为12.6±3.8， SOFA评分为6.8±2.1；生存组中，男性72例，女性59例，平均年龄（54.03±9.74）岁，平均身高为（169.4±9.7） cm，平均体重为（61.2±5.3） kg， BMI为（23.4±2.7） kg/m2， APACHE Ⅱ评分为12.1±1.8， SOFA评分为6.2±1.6。两组患者的性别、年龄、身高、体重、BMI、APACHE Ⅱ评分和SOFA评分比较，差异无统计学显著性。本次研究经杭州师范大学附属医院医学伦理委员会审核通过。

2　方法

2.1外周血白细胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6）水平的检测在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹静脉血3 mL，置于抗凝管内，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血浆中IL-1β和IL-6的水平，其中IL-1β由Abcam提供的人IL-1β ELISA试剂盒（货号ab46052）进行检测， IL-6由Thermo Fisher Scientific提供的人IL-6 ELISA试剂盒（货号：EH2IL6）进行检测。

2.2血清肌酐（serum creatinine， SCr）水平的检测在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹静脉血3 mL， 3 000 r/min离心10 min，收集上层血清，采用由贝克曼库尔特公司提供的AU680全自动生化分析仪，检测患者SCr的含量。

2.3自噬相关蛋白mRNA表达水平的检测第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹静脉血5 mL，置入肝素抗凝管内，加入等量的Ficoll淋巴细胞分离液（北京同立海源生物科技有限公司），于室温500×离心20 min，吸取最上层血浆，收集血浆层与淋巴细胞分离液交界面的单核细胞。加入1倍体积的含有5×103U/L肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液， 200×离心10 min，吸取上清液，重复洗涤2次，用1%台盼蓝检测细胞活力，细胞活力应>95%，进行细胞计数后，将单核细胞储存于-80℃。在冷冻的单核细胞中加入Trizol溶液（Thermo Fisher Scientific），严格按照Trizol溶液的说明书提取单核细胞中的RNA，采用NanoDrop 2000分光光度计检测所提取RNA的质量。吸取1 µg合格的RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix （TaKaRa）将RNA逆转录成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System （Thermo Fisher Scientific）上进行RT-qPCR，检测微管相关蛋白1轻链3-II （microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）、自噬相关蛋白5 （autophagy-related protein 5， Atg5）和beclin-1的mRNA表达量。PCR条件为： 94℃ 1 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 40个循环。所有实验孔重复4次，以GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt计算各基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4观察指标比较第1次CRRT前和多次CRRT后AKI患者血浆IL-1β和IL-6蛋白水平，以及血单核细胞中LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表达水平，并进一步分析上述分子水平与SCr含量的关系。同时对CRRT治疗28 d后的生存组和死亡组患者上述基因的表达水平进行比较

3　统计学处理

采用SPSS 22.0 for Mac软件进行数据统计和分析。计量资料经正态分布检验后采用均数±标准差（mean±SD）的形式表示，组间采用独立样本检验进行比较，CRRT前后比较采用配对样本检验；计数资料采用频数（率）的形式表示，组间采用卡方检验进行比较；指标间的相关性采用Pearson’s相关性分析进行研究。以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平的比较

CRRT后，所有患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平均比治疗前显著下降（<0.05），见表2。

2　CRRT前后AKI患者单核细胞中自噬相关分子mRNA水平的比较

CRRT后AKI患者单核细胞中IL3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表达水平均比治疗前显著降低（<0.01），见表2。

表2　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平及单核细胞中自噬相关分子mRNA水平的比较

**<0.01before CRRT.

3　CRRT后生存组和死亡组患者自噬相关分子mRNA水平的比较

死亡组患者治疗后LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表达水平均显著高于生存组（<0.05），见表3。

表3　生存组和死亡组患者CRRT后自噬相关分子mRNA表达水平的比较

**<0.01survival group.

4　IL-1β、IL-6和自噬相关分子表达水平与SCr含量的相关性分析

AKI患者IL-1β （=0.79，=0.032）、IL-6 （=0.66，=0.003）、LC3-II （=0.54，=0.019）和beclin-1 （=0.63，=0.042）水平与SCr含量均呈正相关，而Atg5表达水平与SCr含量无显著相关性（=0.64，=0.328）。

讨论

AKI是指突发且持续的肾功能下降，临床表现为氮质血症、水电解质紊乱、少尿等。AKI的病因可分为肾前性、肾性和肾后性，其中肾前性AKI是临床最为常见的类型，主要是由于全身循环血量减少导致的肾灌注不足，造成肾功能的损害。临床上对于AKI的治疗包括去除病因、稳定内环境、营养支持、处理并发症及给予肾脏替代治疗（renal replacement therapy， RRT）。CRRT是危重患者最常用的血液净化技术，其主要原理是通过模仿肾小球的滤过，运用对流、弥散和对流的原理，清除溶质。与间断血液透析相比， CRRT具有能够稳定血液动力学、较高的溶质清除率、清楚炎性介质等优点［5-6］。既往的研究显示，接受CRRT的危重患者的死亡率约为50%左右，而AKI患者接受CRRT的预后受到启动时间、治疗前血中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）水平、APACHE II评分、炎症因子水平等的影响［7-9］。

自噬是细胞代谢和更新的必要过程，也是帮助细胞在严酷环境下存活的重要生理过程，同时自噬也是细胞凋亡的重要途径。既往的研究发现，自噬体在维持肾脏功能、保护肾小管上皮细胞不受损伤等环节起到重要的作用［10-11］，但对于接受CRRT的AKI患者体内自噬相关分子表达及意义的研究极为欠缺。自噬是一种参与细胞质内细胞器和大分子物质降解的生理行为，且可通过双层膜结构包裹待被降解的物质形成自噬体，且将其转运至自噬溶酶体发生降解作用。LC3-II是一种非常重要的自噬相关蛋白，往往代表自噬体的出现。LC3-II的累积能够激活巨噬细胞相关的免疫反应，释放大量IL-1β、IL-6等炎症因子，从而导致机体炎症反应加剧，组织损伤加重［12-13］。我们的研究结果显示，CRRT能够有效减少患者体内IL-1β、IL-6等炎症因子的聚集，同时亦能减少患者体内LC3-II的表达，提示CRRT能够有效抑制AKI患者的炎症反应和自噬，从而减少对肾脏的伤害。此外， beclin-1是另一种常见的具有自噬活性的分子，它作为PI3K复合体中的一部分，参与自噬体的形成，还能调节Atg蛋白的形成，从而促进细胞自噬［14-15］。相关文献报道，大鼠发生AKI后，自噬相关蛋白beclin-1表达明显上调，且随着缺血时间的延长， beclin-1的表达水平逐渐升高［16］。我们的研究结果显示， CRRT亦能够有效降低beclin-1和Atg5的水平，提示CRRT能够抑制自噬。通过比较不同预后的患者治疗后自噬相关蛋白的表达水平，我们发现存活组患者体内LC3-II、beclin-1和Atg5表达水平都显著低于死亡组，即CRRT后死亡患者体内的自噬情况无明显改变，说明在AKI患者中，自噬相关蛋白表达水平与预后呈负相关，较低的自噬水平可以预测患者治疗后较好的预后。LC3-II和beclin-1作为自噬体膜的标志蛋白，与细胞间的自噬和凋亡均有一定相关性，细胞的自噬和凋亡均可被应激反应所激活，两者甚至可相互转换。相关文献报道，脓毒血症大鼠的自噬体膜蛋白LC3-II和beclin-1表达水平明显升高，并诱发细胞发生凋亡，且自噬蛋白的表达水平与体内的氧化应激反应成正比［17］。本研究中，死亡AKI患者LC3-II和beclin-1的表达水平明显高于存活患者，分析其原因可能是患者中高表达的LC3-II和beclin-1可提高细胞凋亡水平，不利于肾脏修复，最终导致患者死亡。本课题组后续应进一步验证此机制。

综上所述，CRRT能够降低AKI患者外周血自噬相关蛋白的mRNA表达水平，降低自噬水平，对AKI患者发挥保护性作用。自噬相关蛋白的mRNA表达水平可作为预测CRRT预后的重要指标，这为临床治疗AKI提供了新理论和新思路。

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Effect of continuous renal replacement therapy on mRNA expression of autophagy-related molecules and prognosis in patients with acute kidney injury

LÜ Xin， TANG Wen-xue， GUO Liang

（，，310000，）

To explore the effect of continuous renal replacement therapy （CRRT） on mRNA expression of autophagy-related molecules and the prognosis in the patients with acute kidney injury （AKI）.A total of 174 patients from our hospital who were diagnosed to have AKI and underwent CRRT between February 2015 and March 2018 were involved in this study. The plasma levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， the serum creatinine （SCr） level， and the mRNA expression levels of autophagy-related molecules， including microtubule-associated protein 1 light chain 3-II （LC3-II）， autophagy-related protein 5 （Atg5） and beclin-1， in the monocytes from peripheral blood were compared before and after CRRT. According to the survival of AKI patients after 4 weeks of CRRT， the enrolled patients were divided into death group （=43） and survival group （=131）， and the mRNA expression levels of the above molecules were compared between the 2 groups.After CRRT treatment， the plasma levels of IL-1β and IL-6， the level of SCr， and the mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in the monocytes were significantly lower than those before CRRT treatment （<0.05）. The mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in death group were significantly higher than those in survival group （<0.05）. The positive correlation between SCr and IL-1β， IL-6， LC3-II or beclin-1 was observed （<0.05）， and no correlation between SCr and Atg5 was found （>0.05）.CRRT decreases the mRNA expression levels of autophagy-related molecules in the patients with AKI and reduces the autophagy activity， which is protective for the patients. These autophagy-related molecules may be applied as a potential markers to predict the prognosis of CRRT.

Acute kidney injury； Continuous renal replacement therapy； Autophagy； Inflammatory factors； Prognosis

R692； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.023

1000-4718（2020）11-2081-05

2020-07-06

2020-10-23

Tel: 18922750968； E-mail： xufengqing09@163.com

（责任编辑：余小慧，罗森）