基于丁香苦苷抗菌药效研究的丁香叶质量标志物指认

张喜武，杨斯棋，李永吉，刘振强，朱健，张丽丽，窦金金

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

丁香叶为木犀草科植物[1]，味苦、性寒为东北地区特色药材[2]，有清热燥湿、解毒、消炎、利湿退黄之功效[3]。药用价值早在民间就已被认知是一味极具开发潜力的中药，常用于治疗腹泻、爆发性火眼膜炎以及黄疸型肝炎等疾病[4]，体内外都具有较好的抗菌作用[5]。以丁香叶为原料的炎立消胶囊以及片剂等剂型具有很好的抗菌、抗病毒、抗炎作用[6-7]，也有较多文献报道，但究竟是何种成分发挥着抗菌、抗病毒、抗炎作用目前尚不明确，虽有少数综述报道丁香苦苷有可能成为其有效成分，但又都缺乏其抗菌的实验数据。因此，本课题组在明确了丁香苦苷具有抗乙肝病毒作用[8]的研究基础上，又进行了抗菌的实验研究，进而深入挖掘丁香苦苷的药效作用，明确丁香苦苷在丁香叶成分中的药效学位置，为丁香苦苷成为丁香叶的质量标志物奠定研究基础。

1 实验材料

1.1 药品

丁香叶2017年9月采于哈尔滨，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为木犀科Oleaceae丁香属Syringa植物紫丁香SyringaoblataLindl.的干燥叶，样品保存于黑龙江中医药大学药学院(20170918)。丁香苦苷原料实验室自制；丁香苦苷对照品(实验室自制，经面积归一化法测定纯度大于98%)；炎立消胶囊(哈尔滨华瑞生化药业有限公司，批号：20180504)；炎可宁片(吉林敖东延边药业股份有限公司，批号：20180307)；头孢克肟胶囊(哈尔滨三精海灵药业有限公司，批号：20180413)；黄连素片(安徽国森药业有限公司，批号：20180520)；双黄连口服液(哈尔滨中药二厂，批号：20180619)。

丁香苦苷的制备：取丁香叶10 kg，加8倍量水煎煮2次，合并水煎液，浓缩，上HPD 500大孔吸附树脂柱，分别用水、30%(v/v)乙醇、50%(v/v)乙醇洗脱，收集50%(v/v)乙醇洗脱部分。50%(v/v)乙醇洗脱液，减压回收乙醇后，水定容至一定体积，乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂，冷冻干燥，得丁香叶提取物[9]。丁香叶提取物经硅胶柱色谱(CHCl3-MeOH梯度洗脱)分离，分别得到A、B、C、D四组分。组分C再用硅胶柱色谱(CHCl3-MeOH梯度洗脱)分离，获得丁香苦苷原料。

1.2 主要试剂

10%水合氯醛(北京化工二厂，批号：20180521)，分析纯10%福尔马林(北京化工二厂，批号：20180518)，MH肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限公司，批号：20180811)营养琼脂(北京奥博星生物技术有限公司，批号：20180812)。

1.3 菌株

ATCC25923金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、ATCC25922大肠杆菌(Escherichiacoli)、ATCC27853铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、购于黑龙江省农科院；ATCC51210福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、ATCC51203宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、ATCC51054痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、ATCC26104白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、ATCC49103变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)、ATCC46114肺炎杆菌(Pneumobacillus)，购于中国食品药品检定研究院。

1.4 主要仪器

DHP-9272型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，DHC-1300ⅡA/B型生物洁净柜(苏州净化设备有限公司),ZDX-35B型电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

2 实验方法

2.1 定性鉴别

取适量丁香苦苷对照品，加甲醇溶解，制成0.02 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。另取丁香苦苷原料药(20180501)适量，加甲醇溶解，制成0.1 mg·mL-1的溶液，作为供试品溶液。按照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版一部附录ⅤD)试验文献，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温30 ℃；以甲醇-水(50∶50)为流动相；检测波长为221 nm ；流速为1 mL·min-1。取供试品溶液、对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录主峰的保留时间。

2.2 倍比稀释法

采用二倍稀释法，用微量加样器将MH肉汤培养基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取灭菌药液100 μL加到第1孔及第2孔中，从第2孔开始将药液和MH肉汤充分混匀后吸取100 μL加到第3孔中充分混匀后再吸取100 μL加到第4孔中，如此反复，依次稀释至第8孔，混匀后吸取100 μL弃去。每孔分别加入106CFU/mL的菌液100 μL。同时设有不加菌的样品对照孔和不加样品的菌液生长对照孔。置37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察有无细菌生长，按照上述操作流程重复做3次平行实验。

2.3 打孔法

将未稀释前的菌液(即含菌量为5×107～5×108CFU/mL)用棉签均匀涂布在MH琼脂培养皿上，然后用灭菌的6 mm打孔器在MH琼脂上均匀地打6个孔，每孔注入50 μL的供试药物，(各药物浓度为：丁香苦苷原料200 mg·mL-1，炎立消胶囊200 mg·mL-1，炎可宁片200 mg·mL-1，头孢克肟胶囊128 μg·mL-1，黄连素片100 mg·mL-1，双黄连口服液用原液。37 ℃培养，18 h取出，测定抑菌环直径，按照上述操作流程重复做3次平行实验，抑菌环直径取其平均值。

2.4 体外杀菌实验

采用二倍稀释法，用微量加样器将MH肉汤培养基100 μL加到96孔板第2～8孔中，第1孔不加。取灭菌丁香苦苷药液100 μL加到第1孔及第2孔中，从第2孔开始将药液和MH肉汤充分混匀后吸取100 μL加到第3孔中充分混匀后再吸取100 μL加到第4孔中，依次稀释至第8孔，混匀后吸取100 μL弃去。每孔加入106CFU/mL的菌液100 μL，置37 ℃恒温培养箱中培养24 h。按照上述方法再进行炎立消胶囊、炎可宁片、头孢克肟胶囊、黄连素片、双黄连口服液对照药物96孔板实验，实验结束后观察有无细菌生长。以细菌不生长的最低药物浓度为该细菌的MIC值为最终结果。

3 实验结果

3.1 定性鉴别结果

供试品峰保留时间与对照品峰保留时间一致。定性鉴别结果见图1。

图1 丁香苦苷对照品和自制丁香苦苷原料药的色谱图

由图1结果显示，制备得到的丁香苦苷原料药在与对照品色谱相应的保留时间上，呈现相同色谱峰，表明该原料药为丁香苦苷。

丁香苦苷为淡黄色粉末，味极苦，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂。分子式C24H30O11，分子量494.5，熔点156～156.5 ℃。化学结构见图2、图3。

图2 丁香苦苷的化学结构式

图3 丁香苦苷的立体化学结构

UV光谱：λmax nm(ε)221(11 500) ，271(470)。

IR光谱：VKBrmax 1 734，1 692，1 633，1 516，843。

1H-NMR谱：(500 MHz，CD3OD)δ7.00 (2H，d， J=8.5 Hz， H-2″，H-6″) ， 6.68(2H，dd， J=8.5，2 Hz，H-3″，H5″)，2.80(2H，t，J=6.5 Hz，H-α)，4.21(2H，t，J=6.5 Hz,H-β)， 5.57 (1H， d， J=3 Hz，H-1)， 7.40(1H，d，J=6.5 Hz，H-3)， 2.86 (1H，dd， J=12， 2 Hz，H-5)， 2.51(1H， dd，J=19.2，8 Hz，H-6α)，2.37(1H，dd， J=19.2，8 Hz，H-6β)， 2.06(1H， dq，H-8)， 2.28(1H， ddd， J=14，7.2，3.5，H-9)， 4.64(1H，d，J=8 Hz，H-1)， 3.62 (1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6α)， 3.56(1H，dd，J=14，6.5 Hz，H-6′β)。

13C-NMR谱:(500 MHz，CD3OD)δ95.41(C-CH)，153.19(C-3，-CH)， 111.18(C-4，-C)， 28.22(C-5，-CH)， 43.5(C-6，43.5)， 220.74(C-7，-C)， 46.62(C-8，-CH)， 44.46(C-9，-CH)， 13.67(C-10，-CH3) 168.37(C-11，-C)， 100.19(C-1′，-CH)， 74.62(C-2′，-CH)， 77.93 (C-3′，-CH)， 71.53(C-4′，-CH)， 78.36 (C-5′，-CH)， 62.71(C-6′，-CH2)，130.09(C-1″，-C)，130.90(C-2″，C-6″，-CH)， 116.29(C-3″，C-5″，-C)， 157.02(C-4″，-C)， 66.29(C-α，-CH2)，35.26(C-β，-CH2)。

3.2 倍比稀释法实验结果

由表1结果显示，丁香苦苷对选定的9个菌株均有抑菌作用，以细菌不生长的最低药物浓度为该细菌的MIC值为最终结果[10]。其中对白色葡萄球菌及肺炎杆菌抑菌作用较强，MIC为3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；对金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、变形杆菌等5个菌株MIC为12.5 mg·mL-1；对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌抑制作用一般，MIC为50 mg·mL-1。

表1 丁香苦苷的抑菌效果和最低抑菌浓度

3.3 打孔法实验结果

从打孔法实验结果表2可以看出，丁香苦苷与对照药炎立消胶囊和炎可宁片比较可知，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于炎可宁片，稍差于炎立消胶囊，对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌丁香苦苷、炎立消胶囊和炎可宁片均无抑菌环，表明对大肠杆菌抑菌、铜绿假单胞杆菌作用不明显。对白色葡萄球菌、肺炎杆菌、痢疾志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、变形杆菌与炎立消胶囊和炎可宁片的抑菌作用基本相当。对福氏志贺氏菌的抑菌作用比炎立消胶囊和炎可宁片的均强。与双黄连口服液相比较，抑菌作用均不及双黄连口服液明显。与黄连素片对比，黄连素片对铜绿假单胞杆菌有抑菌环，强于丁香苦苷，其余均不及丁香苦苷。

表2 不同供试药物对九种菌株的抑菌环直径(mm)

注:/表示在选定的药物浓度下没有抑菌环。

丁香苦苷对选定的9个菌种中的7个菌种有抑菌作用。对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌没有抑菌环；比较倍比稀释法结果，说明丁香苦苷对这两个菌种的抑菌作用不明显，对其余7个菌种有抑菌作用。

3.4 体外杀菌实验结果

由表3可知丁香苦苷对大部分菌株均有杀菌作用，其中对白色葡萄球菌和肺炎杆菌作用显著，MBC分别3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1；对痢疾志贺氏菌福氏志贺氏菌变形杆菌金黄色葡萄球菌杀菌效果相近；对宋内氏志贺氏菌杀菌作用一般，MBC50 mg·mL-1；在最大药物浓度下对大肠杆菌，铜绿假单胞杆菌没有杀菌作用。

表3 不同供试药物对9种菌株的最低杀菌浓度结果(mg·mL-1)

4 结论

通过丁香苦苷对9种菌株的MIC、MBC、抑菌圈的直径测定，说明丁香苦苷具有良好抑菌活性，白色葡萄球菌及肺炎杆菌抑菌作用强，最低抑菌浓度(MIC)为3.125 mg·mL-1及6.25 mg·mL-1，仅对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌作用不明显。打孔法丁香苦苷对除大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌外7个菌种均出现抑菌环，与倍比稀释法结果一致。丁香苦苷与对照药炎立消胶囊和炎可宁片比较可知，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于炎可宁片，稍差于炎立消胶囊。与黄连素片对比，除黄连素片对铜绿假单胞杆菌强于丁香苦苷外，其余均不及丁香苦苷抗菌效果。由此说明，以丁香叶为原料的炎立消胶囊具有广谱抗菌作用，且作用效果显著，其有效成分丁香苦苷作用与炎立消胶囊相近，可以推断丁香苦苷为丁香叶中抗菌的主要有效成分，进一步增加了丁香苦苷的药用范围。

随着抗生素的发现与应用，多种由致病菌引起的细菌感染性疾病有了很好的控制和治疗效果，但抗菌药物在发挥强大抗菌功效的同时，致病菌也不断对现有药物产生耐药性[11-12]，可供临床选择的抗生素越来越局限，因此，从中药中筛选抗菌药物进行细菌的非抗生素治疗研究具有重要意义[13]。丁香苦苷毒性极小甚至无毒[14]，无不良反应，不易产生耐药性，从实验结果可知，丁香苦苷和炎立消胶囊都是治病杀菌的良药，通过本课题的研究为以丁香叶为原料的炎立消胶囊或者片剂体内外抗菌作用提供实验数据，为开发丁香苦苷的抗菌新药奠定基础。