紫朱软膏对急性创面愈合过程中IL-1β、MMP-9和TGF-β的作用及自噬相关性研究

胡啸明,黄仁燕,韩强,严仕梦,柳国斌*

(1.上海中医药大学附属曙光医院中医血管外科，上海 201203;2.上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240)

创面修复是临床上外科医生经常面对的难题之一，随着医学技术的发展，急性创面一般预后较好，但常因治疗不当或患者基础疾病的原因，易迁延形成慢性难愈性创面，少数有癌变可能。因此，早期急性创面的处理至关重要。

已有研究提示在创面愈合过程中，细胞的自噬水平呈动态变化，决定创面最终的转归。现代基础医学的不断发展，使我们对外科创面愈合机制的认识深入到了细胞与分子水平，从而为指导临床治疗提供了有力的支撑。前期临床实践中发现，中药外用制剂的有效应用，能促进创面快速愈合，尤其在慢性难愈性创面中优势明显。因此，本研究观察以“清热祛腐生肌法”组方的中药紫朱软膏对急性创面愈合的疗效、作用机制以及自噬和创面愈合的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取雄性SPF级SD大鼠30只，体质量(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号SCXK(沪)2012-0002，饲养在上海中医药大学实验动物中心，常规饮食进水，饲养环境：温度: 20～25℃，相对湿度40%～50%，光照周期12 h/日。

1.1.2 药物与试剂

紫朱软膏(100 kg生产处方量包括生药朱砂3.5 kg，紫草1.5 kg，龙血竭3 kg，黄芪1.5 kg，阿胶2.5 kg，冰片0.5 kg,辅料白凡士林、羊毛脂、泊洛沙姆等共87.5 kg)为院内经验方，委托马应龙药业集团股份有限公司按照制作工艺和质控标准生产。生理盐水，四川科技药业股份有限公司。4%多聚甲醛、苏木精染液、1%伊红酒精溶液，国药集团(沪试)，2.5%戊二醛、丙酮、3%醋酸铀-枸橼酸铅，上海生工生物工程技术有限公司。PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，碧云天生物工程有限公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real time)、SYBR®Premix Ex Taq®II (Tli RNaseH Plus)，日本TAKARA公司，Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9、TGF-β一抗和GAPDH，美国Sigma公司。

1.1.3 仪器

EG1160包埋机、石蜡切片机、HI1120水平式烘干仪(型号：德国Leica)，正置显微镜(型号：日本Olympus)，透射电子显微镜(型号:荷兰FEI Tecnai G2 Spirit TEM)，电泳仪(型号：EPS 300，上海)，微型垂直电泳槽(型号：VE 180，上海)，荧光化学发光成像系统(型号：ChemiQ4600，上海)，荧光定量PCR仪(型号：瑞士罗氏LightCycler®96)。

1.2 造模与分组

实验动物适应性饲养3 d，第4天进行造模。①麻醉：10%水合氯醛腹腔内注射，每只剂量标准3 mL/kg；②脱毛：后背部6×4 cm2范围(后脊正中线两侧各延伸3 cm；③制作皮肤创面：以后脊正中线旁开2 cm，用皮肤打孔器(规格内径12 mm)于脱毛区域钻孔，顺钟向旋转，待皮肤分离，用眼科剪配合连带皮下筋膜一并剪去，止血。造模成功后，大鼠按体质量编号，生成随机数字表，随机分为对照组和治疗组，每组 15只。

1.3 干预

治疗组给予紫朱软膏按0.032 g/cm2比例外用换药，1次/d；对照组给予生理盐水外用换药，1次/d；观察周期21 d。

1.4 检测指标与方法

在创面形成后1 d、4 d、7 d、14 d和21 d共5个时间点，每个时间点每组各取3只大鼠，分别进行指标检测。

1.4.1 创面愈合率

将数码相机(5D Mark III，Canon公司，日本)采集的图片导入计算机，选出最清晰图片，用Image-Pro Plus Version 6.0软件计算4、7、14、21 d创面面积，再计算创面愈合率[1],创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.4.2 组织学观察

剪取创面组织标本，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察创面组织形态[2]。

1.4.3 自噬体观察

2.5%戊二醛固定，丙酮脱水、包埋、固化、超薄切片机切成50～60 nm切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察两组大鼠在各时相点的创面组织细胞的自噬体形态、结构[3]。

1.4.4 Western Blot法检测目的蛋白

取大鼠皮肤创面组织50 mg，加入适当量的裂解液，比例为1∶100，充分裂解后，11 000 r/min的4 ℃离心机离心10 min，取上清。按照BCA定量法计算出蛋白浓度，补充适量RIPA液，加入 loading buffer，使各个样本等体积等量上样，煮沸5 min使蛋白变性。50 μg上样量，用15%分离胶使蛋白分离，半干转膜200 mA，1 h使蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶常温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜( 一抗稀释比例1∶1 000，β-actin作为内参) ，二抗(稀释比例1∶1 000)常温孵育30 min，暗室发光，显影，洗片。拍照，用Image J软件计算灰度值并进行分析。

1.4.5 RT-PCR法检测目的基因

取大鼠皮肤创面组织100 mg置于研钵中，加入500 μL TRIzol试剂及100 μL氯仿提取总RNA，应用Prime ScriptTM RT试剂盒进行逆转录制备cDNA。以GAPDH为内参进行荧光定量PCR扩增以检测各组大鼠皮肤创面组织中Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表达水平。扩增引物由美国Thermo Fisher Scientific公司合成，引物序列见表1。反应条件：50 ℃预处理2 min，循环1次；95 ℃预变性30s，循环1次；95 ℃变性5 s，循环40次；60 ℃退火34 s，循环40次；72 ℃延伸30 s，循环40次。各组均设3个复孔。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相对表达量。

表1 引物信息

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 创面愈合率

4 d，两组组创面逐渐缩小，无明显液性渗出。7 d时，两组创面边缘区域部分已结痂，逐渐向中心靠拢，紫朱软膏组创面愈合率达到45%，两组有统计学差异(P<0.01)。14 d时，两组创面面积缩小明显，愈合面积过半，具有统计学差异(P<0.01)。21 d时，紫朱软膏组已基本愈合，愈合率达到 98%，高于对照组，且有统计学差异(P<0.01)。见表2、图1和图2。

表2 两组创面愈合率的比较

图1 两组创面愈合情况

图2 两组创面愈合率比较

2.2 组织学观察

7 d时，与对照组相比，紫朱软膏组有较多成熟肉芽组织和新生毛细血管；14 d时，紫朱软膏组初步形成毛细血管网，上皮组织可见排列较整齐的胶原纤维组织，而对照组上皮组织间隙较多，未见成熟的胶原纤维；21 d时，紫朱软膏组形成规则的毛细血管网，一定数量的腺体结构，而对照组相对较少(见图3)。

图3创面组织HE染色(×100)

2.3 自噬体观察

透射电镜拍照结果如下图所示，7 d时，可以看出NS组出现自噬现象，细胞核染色质开始凝集，核膜有凹陷，胞浆中出现有多层膜或双层膜包绕的泡状结构即自噬泡；14 d时,NS组自噬现象明显比7 d时有所增加。相同时相点，紫朱软膏组细胞核染色质凝集现象明显，核染色质在核质中呈块状凝集，大小不等地分散于核质内，但自噬泡均较对照组明显减少(见图4)。

图4 创面组织内自噬体的电镜观察(Bar=2 μm),红色箭头所示为自噬体

2.4 Beclin-1 、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的检测

对照组14 d时Beclin-1 、LC3蛋白的表达要高于前一时间点7 d，有统计学差异(P<0.05)；MMP-9蛋白的表达在不同时间点有统计学差异(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；各时相点IL-1β蛋白的表达有统计学差异(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。相同时间点，紫朱软膏组Beclin-1 、LC3、IL-1β蛋白的表达要弱于对照组，有统计学差异(P<0.05)，MMP-9和TGF-β的表达要强于对照组，有统计学差异(P<0.05)(见表3、图5)。

表3 两组创面目的蛋白的表达比较

注:Z指紫朱软膏，N指生理盐水。图5 两组创面LC3、Beclin-1、IL-1β、MMP-9和TGF-β蛋白的表达

2.5 Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β基因的检测

2.5.1 各时相点Beclin-1、LC3、IL-1β、MMP-9和TGF-β mRNA的表达变化

对照组各时相点Beclin-1、LC3、MMP-9和TGF-β mRNA的表达有统计学差异(P<0.05)，7 d<14 d<21 d；IL-1β mRNA的表达在不同时相点有统计学差异(P<0.05)，7 d>14 d>21 d。4 d时，紫朱软膏组LC3 、TGF-β mRNA的表达要弱于对照组，有统计学差异(P<0.05)，MMP-9 mRNA的表达要高于对照组，有统计学差异(P<0.05)；7 d时，紫朱软膏组IL-1β、TGF-β mRNA的表达要弱于对照组，有统计学差异(P<0.05)，紫朱软膏组MMP-9 mRNA的表达要高于对照组，有统计学差异(P<0.01)；14 d时，紫朱软膏组Beclin-1、TGF-β mRNA的表达要弱于对照组，有统计学差异(P<0.01)，紫朱软膏组MMP-9 mRNA的表达要高于对照组，有统计学差异(P<0.05)；21 d时，紫朱软膏组IL-1β mRNA的表达要弱于对照组，有统计学差异(P<0.01)，紫朱软膏组MMP-9、TGF-β mRNA的表达要高于对照组，有统计学差异(P<0.05)(见表4)。

表4 两组创面目的基因的表达比较

2.5.2 各时相点IL-1β、MMP-9和TGF-β和自噬基因LC3 mRNA表达变化的相关性

创伤14 d时，IL-1β表达量与LC3显著正相关(r=0.953，P<0.01)；创伤4 d和14 d时，MMP-9表达量与LC3显著负相关(4 d：r-0.916，P=0.01；14 d：r=-0.756，P=0.019)。创伤4 d、7 d和21 d时，TGF-β表达量与LC3显著负相关(4 d：r=-0.911，P=0.001；7 d：r=-0.862，P<0.03；21 d：r=-0.860，P=0.03)(见图6～8)。

图6 各时相点LC3与IL-1β的相关性分析

图7 各时相点LC3与MMP-9的相关性分析

图8 各时相点LC3与TGF-β的相关性分析

3 讨论

在自噬和创面愈合关系的各种研究中结果显示其具有一定的关联性，在烧伤创面中，Beclin-1自噬相关基因高表达，增加自噬活性有利于创面愈合[4]。然而，同时也存在过度的自噬活性表达导致创面愈合延迟的情况。在多项涉及患者或大鼠模型实验的研究中[5-7]，应用自噬诱导剂雷帕霉素，机体最终出现创面延迟愈合。目前，几种小分子调节剂如雷帕霉素、海藻糖、锂和利美尼定参与了自噬途径，已经确定能够调节自噬活性。然而，这些调节剂在临床上的应用仍然有限。常见的雷帕霉素的自噬诱导过程相对缓慢，具有较长的间接作用时间，而且其作用始终是暂时的[8]。因此，寻找新的理想自噬调节剂在临床上具有重要的应用价值。

中医药在治疗创面愈合方面具有显著优势，且多项研究显示中医药对自噬具有调节作用[9-12]。中医认为创面的主要病理因素责之于“热”“瘀”“虚”，病机为“因虚致瘀、瘀久化热、热盛肉腐”，因此以“补气化瘀、清热解毒、化腐生肌”理论来指导创面的治疗[13]。创面愈合不良的因素往往是炎症反应过激及相关生长因子分泌不足，而清热祛瘀生肌中药具有调节炎症反应、促进生长因子生成的作用[14-16]。紫朱软膏是以“清热祛腐生肌法”组方，借鉴我国著名中医外科大家奚九一教授的经验方“捞底膏”，在前期研究的基础上进一步优化形成的经验方，全方以朱砂、紫草为君，其中朱砂具解毒祛腐之功；紫草有凉血活血之效，两君相得益彰，共凑清“热”解毒、祛腐化“瘀”之效；黄芪味甘性微温，为补气生肌之要药，托毒退肿之上品，阿胶、血竭同为甘平之品，均有补血生肌之功，其中阿胶补血滋阴俱佳，血竭为治疗溃疡不敛之要药，三者共为臣药，补气血之“虚”；佐以冰片，味辛，通透肌腠以助药效，有效的针对了“热”“瘀”“虚”病理因素。在本研究中，与对照组比较，紫朱软膏组愈合率高，愈合时间短，创面血管新生、再上皮化速度快，体现出了较好的疗效。

创面修复是一个连续复杂的过程，主要包括炎症阶段、增殖阶段、组织重塑阶段3个密切联系、交互重叠的阶段。在此过程中，细胞的自噬水平呈动态变化。在本研究中，14 d时电镜观察创面自噬现象明显比7 d时有所增加，相同时相点，紫朱软膏组自噬泡均较对照组明显减少；各时相点自噬基因Beclin-1和LC3的表达随时间逐渐升高，相同时相点，紫朱软膏组Beclin-1和LC3的表达要弱于对照组，说明紫朱软膏组可能通过抑制细胞的自噬活性从而促进创面的愈合。

而在创面愈合的各个阶段，自噬发挥的作用有所不同：①炎症阶段，自噬具有调节炎症反应的作用，适度的炎症反应有利于去除异物、细菌和受损组织以防止加重感染，过度持续性、慢性炎症反应会造成创面愈合障碍。自噬可通过调节促炎与抑炎因子的表达，使创面炎症反应趋于平衡，有利于创面修复。自噬体将细胞质成分传递给溶酶体进行降解，而炎症小体是受感染或应激激活的分子平台，这些分子平台调节白介素1β(IL-1β)和IL-18等的成熟。SHI等[17]数据表明自噬伴随着炎症小体活化，活性炎症小体消除可缓解炎症。本研究中，IL-1β 表达量与LC3显著正相关，说明自噬活性增强会加重炎症反应。同一组别IL-1β的表达随着时间变化逐渐下降，而两组同一时相点，紫朱软膏组IL-1β的表达要弱于对照组，表明紫朱软膏组可以抑制过度的炎症反应。②增殖(血管新生和上皮化)阶段，氧化应激会引起局部代谢产物堆积和营养物质匮乏，导致机体进一步损伤，自噬在增殖阶段发挥抗氧化应激作用，通过控制对氧化应激的适应性反应来减少细胞凋亡，促进细胞迁移、增殖和分化。LONG等[18]人的研究表明，诱导降低氧化应激水平，可调节基质金属蛋白酶9(MMP-9)的迁移和增殖相关基因的表达。巨噬细胞对于创面修复至关重要，LIAO等[19]研究显示上调自噬水平，通过MAPK1/3磷酸化途径增加MMP9的活性可促进巨噬细胞的迁移。本研究中， MMP-9 表达量与LC3显著负相关，细胞自噬活性增强减少了MMP-9的表达，与既往研究不尽相同。同一组别MMP-9的表达随时间逐渐升高，而两组同一时相点，紫朱软膏组MMP-9的表达要强于对照组，表明紫朱软膏组表现出更好的血管新生、上皮化能力。③组织重塑阶段，主要涉及成纤维细胞(FB)的过度增殖以及细胞外基质(ECM)的沉积，自噬可通过调控FB的凋亡和ECM的合成与降解来促进组织瘢痕的重建。转化生长因子β(TGF-β)是创面修复中的重要信号分子，可调节各种类型细胞的增殖、分化和死亡，其参与胶原及细胞外基质的合成与降解，TGF-β与瘢痕愈合有关，可诱导体内各种组织纤维化反应等[20]。DING等[21]研究表明，LC3缺乏诱导自噬水平降低可引起促纤维化因子TGF-β的升高，从而导致胶原沉积的增加和成熟，加速纤维化进程。本研究中，TGF-β表达量与LC3显著负相关，细胞自噬活性减弱有利于TGF-β的产生；而同一组别TGF-β的表达随时间逐渐升高，两组同一时相点，紫朱软膏组TGF-β的表达要强于对照组，表明紫朱软膏组更易诱导组织纤维化形成瘢痕。

本研究结果表明，紫朱软膏的作用机制可能是在创伤修复过程中抑制细胞的自噬活性，通过下调IL-1β的表达抑制炎症反应，上调MMP-9和TGF-β的表达促进血管新生、组织纤维化，从而达到创面愈合的目的。相关研究结果显示，IL-1β能通过增强MMP-9 mRNA的稳定性，进而介导MMP-9的高表达[6]。也有研究表明，MMP-9可通过其水解作用使TGF-β转变为活性状态[22]。MMP-9可能在创面修复自噬机制中承担着关键角色，有可能成为潜在的治疗靶点，但有待进一步深入研究证实。