白花香莲解毒颗粒质量标准研究

黄鹏，邱华，范春娇，苏翠丽，李家焕，李旺，蒙荫杰，何锦轶

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

白花香莲解毒颗粒是在壮医“毒虚致病”理论指导下，由白花蛇舌草、黄花倒水莲、三叶香茶菜、排钱草共4味壮药组成，具有攻毒补虚、疏三道、通两路、调三气、平阴阳之效，是广西中医药大学第一附属医院的临床经验方，至今已有十余年的临床应用历史，主要用于治疗慢性乙型肝炎，在提高HBV阴转率、增加HBeAg血清学转换率、改善生活质量等方面具有显著疗效[1-9]。控制好药品的质量，以确保该制剂的临床疗效，这对于提高广西慢性乙型肝炎治疗水平及民族医药产业创新能力，推动学科内涵建设发展具有重要的示范性意义。本研究采用薄层色谱法对制剂中的白花蛇舌草和三叶香茶菜进行定性鉴别，并检查白花香莲解毒颗粒的粒度、水分、溶化性、装量差异和微生物限度，运用高效液相色谱法对白花蛇舌草的特异性成分去乙酰车叶草酸甲酯的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZF-20C型暗箱式自动紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)，Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，SQP型电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，HWS-28型电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)，101-2型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)，LRH-250-S型恒温恒湿培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)，JM-A6002型电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)。

1.2 试药

白花香莲解毒颗粒(广西中医药大学附属瑞康医院药物研发中心制备，批号分别为20171201、20171202、20171203)，白花蛇舌草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号:201605)，齐墩果酸对照品(上海安谱实验科技股份有限公司，批号：U4070025)，去乙酰车叶草酸甲酯对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17101706)，乙腈为色谱纯(美国Fisher公司，批号：166579)，其它试剂均为分析纯。白花蛇舌草、排钱草、三叶香茶菜、黄花倒水莲四味药材均购于药市，经广西中医药大学廖月葵教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 白花蛇舌草的薄层色谱鉴别

分别取白花香莲解毒颗粒(批号分别为20171201、20171202、20171203)粉末适量，称取约11 g，加入30 mL乙醇，超声处理，滤纸过滤，蒸干滤液，残渣中加入5 mL无水乙醇，溶解，过滤，滤液蒸干，加入1 mL甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。称取白花蛇舌草对照药材3 g，加水50 mL，回流提取1 h，滤纸过滤，滤液浓缩至15 mL，加入30 mL乙醇，搅拌过滤，滤液浓缩至2 mL，加入适量的硅藻土，搅拌均匀，干燥，加入30 mL乙醇，过滤，蒸干滤液，再加入乙醇1 mL使残渣溶解，作为对照药材溶液。另取去乙酰车叶草酸甲酯对照品，以浓度1 mg/mL配制溶液，作为对照品溶液。再取缺白花蛇舌草颗粒适量，与供试品同样制备方法制成阴性对照溶液。根据薄层色谱法(通则0502)的试验[10]，吸取上述四种溶液各5 μL，分别点状于同一个硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-水(5∶1.5∶0.1)作为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显示清晰。在供试品色谱图中，同一颜色的斑点显示在对照品色谱图的相应位置。见图1。

注：1～3为供试品溶液(颗粒批号分别为20171201、20171202、20171203)；4为白花蛇舌草对照药材溶液；5为白花蛇舌草阴性颗粒溶液；6为去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液。图1 白花蛇舌草薄层色谱图

2.1.2 三叶香茶菜的薄层色谱鉴别

分别称取白花香莲解毒颗粒(批号分别为20171201、20171202、20171203)3 g，加入10 mL甲醇，超声处理，过滤，蒸干滤液，加入2 mL甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。按上述相同制备方法，称取三叶香茶菜对照药材1 g，制备成对照药材溶液。另取齐墩果酸对照品，以浓度0.5 mg/mL配制溶液，作为对照品溶液。再取缺三叶香茶菜与白花蛇舌草的颗粒3 g，与供试品同样制备方法制成阴性对照溶液。根据薄层色谱法(通则0502)的试验[10]，吸取上述四种溶液各7 μL，分别点状于同一个硅胶G板上，以环己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显示清晰。在供试品色谱图中，同一颜色的斑点显示在对照品色谱图的相应位置。见图2。

注：1～3为供试品溶液(批号分别为20171201、20171202、20171203)；4为三叶香茶菜对照药材溶液；5为三叶香茶菜阴性颗粒溶液；6为齐墩果酸对照品溶液。图2 三叶香茶菜薄层色谱图

2.2 白花香莲解毒颗粒的粒度、水分、溶化性、装量差异和微生物限度检查

根据《中国药典》[11](2015年版四部颗粒剂通则，0982第二法双筛分法、0832烘干法、可溶颗粒溶化性测定法、装量差异测定法、1105微生物计数法、1106控制菌检查法及1107非无菌药品微生物限度标准)，分别测定三批中试颗粒的粒度、水分、溶化性、装量差异和微生物限度，结果见表1，表2。

表1 白花香莲解毒颗粒粒度、水分、溶化性、装量差异检查结果

表2 白花香莲解毒颗粒微生物限度检查结果

2.3 去乙酰车叶草酸甲酯的含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：水-乙腈 (91∶9) ；检测波长：238 nm；柱温：30 ℃；流速：0.85 mL/min；进样量：5 μL。

2.3.2 标准品溶液的制备

取去乙酰车叶草酸甲酯标准品适量，精密称定，加入9%乙腈水配制成以浓度1.014 mg/mL为标准溶液作为储备液，精密吸取储备液适量，加流动相配制成浓度15.21 μg/mL的标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜，得到标准品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取中试颗粒适量，研细，取0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加水20 mL，精密称定，用超声溶解，冷却，用水补量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得到供试品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液的制备

取缺白花蛇舌草的阴性颗粒适量，按2.3.3项下的方法配制阴性对照溶液。

2.3.5 系统适应性试验

吸取标准品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液分别按上述色谱条件进样5 μL，记录色谱图，结果如图3～图5所示。在标准品溶液去乙酰车叶草酸甲酯的出峰位置(a)，供试品溶液在相同位置出峰且能较好分离(R>1.5)，阴性对照溶液在同一位置没有出现峰值。阴性对照样品对去乙酰车叶草酸甲酯的含量测定无影响。

图3 供试品溶液

图4 去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液

图5 白花蛇舌草阴性对照溶液

2.3.6 线性关系考察

精密吸取标准储备液去乙酰车叶草酸甲酯适量，加流动相配制成浓度分别为5.070、10.14、15.21、20.28、30.42、40.56 μg/mL的标准品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，按上述色谱条件测定。以标准品浓度(μg/mL)为横向坐标(X)，峰面积积分值为纵向坐标(Y)绘制标准曲线，回归方程为Y=11.45X+1.016，r=0.999 9，去乙酰车叶草酸甲酯在5.07～40.56 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.7 精密度试验

精密吸取2.3.2项下的标准品溶液按上述色谱条件连续进样6次，并记录所计算的峰面积的RSD为1.70%，表明本方法精密度良好。

2.3.8 稳定性试验

称取中试颗粒适量，按2.3.3项下的方法配制供试品溶液，在0～24 h内，每隔4 h进样5 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算RSD值。结果在24 h内，去乙酰车叶草酸甲酯峰面积的RSD值为0.50%，表明该溶液在24 h内非常稳定。

2.3.9 重复性试验

称取中试颗粒适量，6份，按2.3.3项下的方法配制供试品溶液，分别吸取供试品溶液5 μL注入色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算RSD值。结果在含量测定条件下，去乙酰车叶草酸甲酯峰面积的RSD为0.96%，表明此方法重复性好。

2.3.10 加样回收率试验

称取已知含量的中试颗粒(含量为0.517 7 mg/g)约0.6 g，6份，精密称定，加入适量的标准储备液(1.014 mg/mL)，按2.3.3项下的方法配制供试品溶液，分别吸取供试品溶液5 μL，按上述色谱条件测定，计算回收率和RSD值，结果见表3。

表3 加样回收试验考察结果

2.3.11 样品测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，按上述色谱条件对三批中试颗粒进行含量测定，每批样品平行测定3份，结果三批中试颗粒的含量测定结果变化幅度不大。含量限度以批次最低含量(0.489 7 mg/g)下调20%计，确定颗粒中有效成分的最低含量限度，即每袋(14 g)去乙酰车叶草酸不低于5.5 mg。见表4。

表4 中试颗粒去乙酰车叶草酸甲酯含量测定结果

3 讨论

3.1 薄层鉴别

本试验所确定的薄层色谱法可鉴别出白花香莲解毒颗粒中白花蛇舌草和三叶香茶菜，方法简单、稳定，可作为白花香莲解毒颗粒的定性鉴别方法。白花蛇舌草主要含有蒽醌类、黄酮类、萜类等化学成分[11]，参照《中国药典》2015年版四部花红颗粒以及清肾颗粒中的方法对白花蛇舌草进行定性鉴别，结果表明，薄层色谱清晰，重现性好，专属性强。三叶香茶菜来源于唇形科香茶菜属植物的干燥全草，主要含有齐墩果酸、熊果酸等有效成分[12]，其中齐墩果酸、熊果酸常为三叶香茶菜质量控制的指标，两者互为同分异构体，薄层鉴别很难分离这两个成分。本课题组选择齐墩果酸作为三叶香茶菜薄层鉴别的对照品，因白花蛇舌草中也含有齐墩果酸，故以双阴颗粒制备阴性对照溶液，以免对薄层结果进行干扰。广西壮族自治区瑶药材质量标准(第一卷)中对排钱草进行定性鉴别时，对照品为β-谷甾醇，而白花香莲解毒颗粒中白花蛇舌草和三叶香茶菜均含有β-谷甾醇，且其为脂溶性成分，故此方法不适用于排钱草的定性鉴别。本课题组曾考虑用排钱草的成分N，N-二甲基色胺、5-甲氧基-N，N-二甲基色胺进行薄层鉴别，但由于实验条件的限制，较难自制出以上两种成分，故放弃此方法进行薄层鉴别。本课题组参照三草护肝胶囊薄层鉴别中的方法，对排钱草和黄花倒水莲进行薄层鉴别时，发现阴性颗粒在相应的位置干扰较大，曾多次试验都无法去除阴性颗粒斑点的干扰，且两者薄层鉴别的文献记载有限，故本试验未能建立排钱草和黄花倒水莲薄层鉴别的方法。

3.2 含量测定

本试验采用主药的特异性成分去乙酰车叶草酸甲酯作为白花香莲解毒颗粒质量控制的指标，通过查阅《中国药典》2015年版四部花红颗粒中关于去乙酰车叶草酸甲酯含量测定的方法，建立了测定去乙酰车叶草酸甲酯含量的方法，从而快速、简便、有效的控制了该制剂的质量。