miR-372通过程序性细胞死亡4调节白血病细胞U937增殖和凋亡

唐 懿 刘彦麟 宋 黎

白血病是世界范围内的公共卫生问题，是常见的血液恶性肿瘤，白血病的恶性程度较高、预后差，通过有效的生物学手段抑制白血病进展显得极为紧迫[1]。研究表明，白血病中有多种基因表达改变，这些基因有望成为治疗白血病的生物靶标，研究白血病的分子发生机制对于寻找有效的白血病分子标记物具有重要意义[2]。miRNA是长度约为20nt的小分子RNA，在真核生物体内表达广泛，miRNA生物学功能多样，其在组织生长、疾病发生、胚胎发育、细胞分化等过程中发挥调控作用[3]。miRNA在人类肿瘤中的作用引起广泛关注，目前已经发现了多个miRNA在肿瘤中表达改变，这些miRNA是潜在的肿瘤治疗生物靶标[4]。miR-372在肿瘤中表达改变，影响肿瘤细胞的生长、凋亡，而且在不同来源的肿瘤组织中的作用不同[5]。miR-372在结直肠癌中发挥促进作用，而在肾细胞癌中发挥抑制作用[6,7]。既往研究[8]显示，白血病患者miR-372表达上调，抑制miR-372的表达可减弱白血病细胞的迁移能力。现阶段对于miR-372在白血病细胞凋亡中的作用还不明确。本次实验体外观察miR-372对白血病细胞U937增殖和凋亡作用并分析其可能机制，以期为白血病的分子靶向治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

白血病细胞U937购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM购自美国Sigma(FG0445)；胎牛血清购自美国GIBCO(10270106)；荧光素酶活性测定试剂盒购自美国Ybscience(YB130597-100)，Bax抗体购自上海酶联生物科技有限公司(ml090462)；Bcl-2抗体购自北京百奥莱博科技有限公司(K11176)，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen(11668)；miRNA提取试剂盒(DP501)、miRNA第一链cDNA合成试剂盒(KR201)购自天根生化科技(北京)有限公司；程序性细胞死亡4(Programmde Cell Death 4,PDCD4)抗体购自北京义翘神州科技有限公司(11547)；miR-372 inhibitor和inhibitor control购自吉满生物科技(上海)有限公司；PDCD4 siRNA、siRNA control由上海吉玛制药技术有限公司构建，Multiskan Sky酶标仪购自美国Thermo Fisher；Amnis®ImageStream®X MK Ⅱ流式细胞仪购自德国Merck；DMi1倒置显微镜购自德国徕卡。

1.2 细胞转染和分组

将白血病细胞U937接种到24孔板，于37℃、5% CO2培养箱内培养，细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM，于次日细胞密度为50%时采用Lipofectamine 2000进行细胞转染。转染操作完全按照转染试剂说明书进行。转染miR-372 inhibitor和inhibitor control的白血病细胞命名为Anti-miR-372组和Anti-NC组，把未行转染的白血病细胞设置为Control组。将PDCD4 siRNA和miR-372 inhibitorsi以及RNA control和miR-372 inhibitor分别共转染到白血病细胞中，命名为Anti-miR-372+si-PDCD4组、Anti-miR-372+si-NC组。

1.3 qRT-PCR测定miR-372表达

转染后常规培养48h,而后收集各组细胞，用D-Hanks液将细胞洗涤2次，1 200g离心10min，弃上清，用miRNA提取试剂盒提取miRNA。miRNA用无RNA酶的ddH2O溶解后，于-80℃环境中储存。按照miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行反转录，首先在miRNA的3＇端加Ploy(A)，然后取Ploy(A)修饰以后的miRNA进行逆转录反应，逆转录反应体系如下：2μl的Poly(A)反应溶液、2μl的RT primer、2μl的RT Buffer、1μl的Super pure dNTPs、1μl的RNasin、0.5μl的Quant RTase，最后加RNase-free ddH2O至20μl，用移液器反复吹打后，37℃反应60min，将cDNA于-20℃冰箱储存。按照qRT-PCR反应试剂进行PCR反应，在冰上配制PCR体系，包含：Forward Primer和Reverse Primer各0.4μl、1μl的cDNA、10μl的miRcure miRNA premix，最后加RNase-free ddH2O至20μl，扩增条件：94℃ 2min预变性，94℃ 20s，60℃ 34s，一共45个循环。以U6或CAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-372或PDCD4 mRNA相对表达量。miR-372引物为：Forward Primer 5＇-GCC CGC AAA GTG CTG CGA CAT-3＇，Reverse Primer 5＇-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3＇；U6 Forward Primer 5＇-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3＇，Reverse Primer 5＇-CGC TTC AGA ATT TGC GTG TCA T-3＇。PDCD4 mRNA表达结果以GAPDH作为内参，引物如下：PDCD4 Forward

Primer 5＇-CCA AAG AAA GGT GGT GCA-3＇，Reverse Primer 5＇-TGA GGT ACT TCC AGT TCC-3＇。GAPDH Forward Primer 5＇-CAA CGG ATT TGG TCG TAT T-3’，Reverse Primer 5＇-CAC AGT CTT CTG GGT GGC-3＇。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将各组细胞接种到96孔板，接种时细胞密度为3×104个/ml，每孔100μl细胞悬浮液，于37℃孵育培养24h、48h、72h以后，加10μl的CCK-8工作液，37℃孵育4h以后，用不含细胞孔调零，检测450nm的A值，A值越大，细胞增殖能力越强。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

Control、Anti-NC、Anti-miR-372组细胞于37℃，5% CO2培养箱，常规培养48h以后，收集各组细胞，1 000g离心10min，弃上清，细胞经PBS溶液洗涤2次后加入结合缓冲液400μl，然后分别加入5μl的PI以及5μl的Annexin V-FITC溶液，在避光条件下结合20min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.6 Western blot检测Bax、Bcl-2、PDCD4蛋白表达

各组细胞于37℃，5% CO2培养箱，常规培养48h以后收集各组细胞，用RIPA蛋白裂解试剂提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白浓度。将胶板置于电泳仪中，添加电泳液，每个孔内分别加入30μg蛋白样品(蛋白在添加至凝胶孔之前，需要与Loading Buffer混合煮沸变性)。首先使用80V的电压电泳30min，然后以120V的电压电泳2h。将PVDF膜放在甲醇中浸泡1min，然后和滤纸、海绵等一起浸泡在转移缓冲液中10min。以250mA的电泳转膜1.5h。将PVDF膜取出，放在5%的脱脂奶粉溶液中，37℃结合1h。再将PVDF膜置于不同浓度稀释的一抗稀释液中(Bax、Bcl-2、PDCD4抗体按照1∶800稀释)，于4℃孵育1h后再将PVDF膜放在HRP标记的二抗稀释溶液中37℃结合1h(二抗按照1∶4 000稀释)。配制好ECL显色试剂，滴加到PVDF膜上，5min后显影仪显影。用Image J软件分析内参GAPDH和目的条带Bax、Bcl-2、PDCD4的灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值表示该蛋白的相对表达水平。

1.7 miR-372靶向关系预测和鉴定

采用Targetscan生物信息数据库预测miR-372的靶基因，并利用荧光素酶报告系统鉴定miR-372与PDCD4的靶向关系。将PDCD4的3＇UTR端结合位点突变，构建突变型荧光素酶报告载体(PDCD4-MUT)，同时构建没有突变的野生型荧光素酶报告载体(PDCD4-WT)。PDCD4-MUT和PDCD4-WT由湖南普拉特泽生物科技有限公司构建。将PDCD4-MUT和PDCD4-WT分别与miR-372 inhibitor和inhibitor control共转染到白血病细胞U937中，培养48h后，用荧光素酶活性测定试剂盒检测白血病细胞荧光素酶活性。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-372 inhibitor下调白血病细胞中miR-372表达水平

各组细胞miR-372水平差异有统计学意义(P<0.01)。Anti-miR-372组白血病细胞中miR-372表达水平明显低于Anti-NC组(t=15.51，P<0.01)，见表1。

表1 三组白血病细胞中miR-372表达水平比较

2.2 下调miR-372对白血病细胞增殖和凋亡的影响

各组细胞增殖和凋亡水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与Anti-NC组比较，Anti-miR-372组白血病细胞24h、48h和72h增殖能力均降低(t=7.38、8.49、22.88，P<0.01)，细胞凋亡率升高(t=31.47，P<0.01)，细胞中Bax蛋白表达水平升高(t=11.71，P<0.01)，Bcl-2蛋白表达水平下降(t=9.60，P<0.01)，差异均有统计学意义；与Anti-miR-372+si-NC组比较，Anti-miR-372+si-PDCD4组白血病细胞增殖能力升高(t=4.95、8.75、10.76，P<0.01)，凋亡率降低(t=16.40，P<0.01)，Bax蛋白表达水平降低(t=6.56，P<0.01)，Bcl-2蛋白表达水平升高(t=8.84，P<0.01)，差异有统计学意义。见图1、图2和表2。

表2 各组白血病细胞增殖、凋亡以及Bax和Bcl-2蛋白水平比较

图2 各组白血病细胞Bax、Bcl-2蛋白表达(Western blot)2.3 miR-372与PDCD4靶向调控作用

miR-372与PDCD4的3＇UTR端有互补结合位点；与Anti-NC组比较，共转染PDCD4-WT后的Anti-miR-372组白血病细胞荧光素酶活性升高(P<0.01)，miR-372与PDCD4互为靶向关系。见图3和表3。

表3 转染PDCD4-WT和PDCD4-MUT后白血病细胞荧光素酶活性比较

图3 miR-372和PDCD4的3＇UTR端结合位点

2.4 下调miR-372对白血病细胞PDCD4表达的影响

各组细胞PDCD4 mRNA和蛋白水平差异有统计学意义(P<0.05)。与Anti-NC组比较，Anti-miR-372组白血病细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(t=11.77、12.90，P<0.01)；与Anti-miR-372+si-NC组比较，Anti-miR-372+si-PDCD4组白血病细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义(t=18.63、13.73，P<0.01)，见图4和表4。

图4 Western blot检测白血病细胞PDCD4蛋白表达

表4 各组白血病细胞PDCD4 mRNA和蛋白水平比较

3 讨 论

miRNA是目前发现的与肿瘤关系密切的非编码RNA，miRNA在肿瘤组织以及正常组织中表达改变，这种差异变化往往与恶性肿瘤细胞的凋亡、生长等生物学行为有关，miRNA也成为潜在的肿瘤治疗的分子靶标[9]。miR-372作用广泛，在人体内的多个组织中表达，影响细胞生长[10]。很多研究显示，miR-372在肿瘤中表达异常，并且miR-372在不同的肿瘤中的作用明显不同[6,7]。miR-372在鼻咽癌、骨肉瘤等癌症进展中具有抑制作用，而在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等癌症中发现miR-372具有促进肿瘤细胞生长的功能[6,11-14]。既往研究表明，miR-372在白血病患者中表达上调，敲低miR-372可降低白血病细胞迁移率[8]。本文结果显示，下调miR-372的白血病细胞增殖水平降低，细胞凋亡率升高，提示下调miR-372具有抗白血病细胞恶性表型的作用，证明miR-372在白血病中可能发挥促进功能。

细胞凋亡减少是肿瘤细胞的特点之一。与正常细胞一样，肿瘤细胞的凋亡受到细胞内诸多基因的调节，这些基因通过复杂的网络调控功能共同影响细胞凋亡发生[15]。Bcl-2是调控细胞凋亡进程的蛋白家族，包含多个蛋白成员，分别在细胞凋亡过程中发挥促进和抑制作用[16]。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中表达上调，具有诱导细胞凋亡的作用[17]。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中表达下调，具有减少细胞凋亡的作用[18]。本文结果显示，下调miR-372后的白血病细胞中的Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平下降，提示下调miR-372可诱导白血病细胞凋亡，这与细胞凋亡检测结果一致。

miRNA虽然没有编码蛋白功能，但是其作用却十分广泛，这与miRNA调控机制有关[19]。miRNA可以通过碱基互补的方式与靶mRNA的3，UTR端结合，从而阻碍蛋白的表达，miRNA的靶基因有多个，并且在不同的组织中的靶基因可能不同[20]。本研究结果发现，miR-372与PDCD4互为靶向关系，并且下调miR-372可以提高白血病细胞中PDCD4的表达水平。PDCD4是一种细胞凋亡调节因子，也是目前发现的抑癌基因，PDCD4在肿瘤组织中表达下调，过表达PDCD4可以降低肿瘤细胞的恶性程度[21-23]。本实验表明，下调PDCD4可以提高下调miR-372的白血病细胞增殖能力，减少细胞凋亡，提示下调miR-372通过靶向PDCD4影响白血病细胞增殖和凋亡。

总而言之，miR-372可能是白血病治疗的生物靶标，下调miR-372通过靶向上调抑癌基因PDCD4的表达诱导白血病细胞凋亡、抑制细胞增殖，这种作用机制为白血病的靶向治疗提供了可能，也为研究miR-372在肿瘤中的网络调控机制提供了资料。