不规范使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗的慢性乙肝患者的HBV耐药基因突变情况

张秀英

江苏省常州市第三人民医院检验科，江苏常州213001

慢性乙肝肝炎在我国发病率较高，与我国的饮食和生活习惯存在一定联系，患者感染乙肝病毒后，出现慢性肝病、肝硬化以及肝细胞癌，对生命健康造成非常严重的威胁。干扰素是目前治疗慢性乙肝中效果较好的药物，疗效方面得到肯定，不良反应较小，在临床中应用率较高。但是乙肝病毒属于一种高变异性的病毒，HBV在体内主要以准种的形式存在和分布，并且随着人体类核苷酸类药物的长期使用，耐药性进一步增加，因此在进行治疗的过程中如何有效避免具有耐药性的准株繁殖成为目前治疗慢性乙肝需要关注的问题，科学地进行耐药性的干预，可以减少不规范药物使用造成的治疗失败等情况，全面提升疾病的治疗质量，对疾病进行更加科学规范的治疗[1]。该文对2016年1月—2018年12月期间60例慢性乙肝患者不规范使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗的HBV耐药基因突变情况进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

60例慢性乙肝患者均在该院接受治疗，纳入指标：①符合国家肝病学以及感染病对慢性乙肝的诊断标准，具有不规范使用核苷酸类治疗药物的历史，在药物使用之后存在各项不良反应，治疗的依从性较差，不愿接受长期服药治疗，但是尚未达到指标规定的治疗效果；②未咨询医生情况下，自行更换治疗药物或方案；③接受抗病毒治疗后无法遵医要求回院接受检查，对于疾病的各项情况了解不清晰；④自行延长药物服用间隔时间，经常漏用药物，药物使用不规范。排除指标：①实施规律性的服药，并进行定期的随访工作，待各项指标恢复至正常水平之后停药；②完全依从并遵医嘱接受治疗，按时复院检查，发现无应答或病毒性突破；③治疗无不规范情况，并且检查中未发生病毒反弹、疾病复发的情况[2]。患者中，男性44例，女性16例；年龄处于21～67岁之间，平均年龄为（44.85±32.46）岁。该实验实施之前已经得到医院伦理委员会的论证，患者也了解实验各项内容，并签署了同意书。

1.2 方法

实验前详细查看护士做的护理记录表，了解患者情况、用药病史和现状，查看患者肝功能生化检验指标，并获取患者完整的临床就诊记录，采集预后转归之后的详细信息。

实验采用抽取静脉血的方式获取样本资料，血液样本采集前8 h禁食禁饮，于清晨时间段采集静脉血5 mL，离心后提取血清，将其放置于-20℃环境中进行存储，并使用PCR反向点杂交法对乙肝病毒的耐药变异和基因类型进行测试，与患者临床资料中药物使用历史、药物使用方法等基本资料进行对比分析，确定患者病毒P区基因序列突变率以及突变的形式[3]。

检测中首先对HBV DNA进行提取，在1.5 mL离心管中加入200μL HBV DNA提取液1 200μL待检血清，混合后震荡使其均匀，之后使用13 000 rpm进行离心，时间为5 min，将上清液废弃，加入50μL HBV DNA提取液2，充分震荡混合，于水沸腾点红瓯下脱干，10 min后将三氯甲烷5μL加入其中，于离心率为12 000 rpm转下离心5 min，将配置好的PCR反应体系加入1.50μL DNA，使总反应体积增加至25μL[4]；进行PCR反应，结合实际温度不同选择适宜的反应时间，如在50℃环境下变性，时间控制在2 min，在95℃环境下进行预变性，时间则为10 min，如在94℃环境下变性时间可控制在60 s，需在实验中对指标进行更加科学的控制；经过95℃变性之后，实施杂交，将样本与25μL反应物进行混合，放置于杂交试剂盒A液中，在47℃环境下杂交1.5 h，后进行洗膜与显色，在预热47℃预热B液进行洗涤，时间为20 min，并进行避光显色，时间30 min[5]。

1.3 观察指标

①分析突变形式以及突变率。突变形式包括M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V。②分析不同基因型突变率，基因型包括B型、C型、BC混合型以及非BC混合型。

1.4 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用[n(%)]表示，进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分析突变形式以及突变率

突变率分析，总发生率为70.00%，比例较高，而不同突变形式分析，发现主要突变形式为M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V，发生率分别为16.67%、18.33%、21.67%、13.33%，见表1。

表1 分析突变形式以及突变率Table 1 Analysis of mutation form and mutation rate

2.2 分析不同基因型突变率

分析不同基因型突变率，发现B型占据比例最高，为59.52%，其次为C型，19.05%，BC混合型发生率最低，仅为7.14%，见表2。

表2 分析不同基因型突变率Table 2 Analysis of mutation rates of different genotypes

3 讨论

慢性乙肝病毒的准种突变序列分布较为稳定，但是其在突变谱中的自我复制功能最强，可以将抗药性突变序列转化为优势序列进行再次复制，因此乙肝病毒属于一种具有高变异性的病毒，在持续的感染中可以变异，并使人体出现免疫应答，造成药物的使用质量受到影响，同时也会影响疫苗的使用效果。慢性乙肝患者在长时间使用一种药物之后，体内的乙肝病毒准种可发生突变，并将植株进行大量的繁殖，造成植株的耐药性增加[6]，治疗难度增大，病情出现反复。因此在使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗初期，应选择高耐药基因屏障类的药物，可以提升疾病的治疗质量。而对于乙肝出现复发的患者，则需要对其发作阶段的病毒准种结构进行分析，确定停药复发的病毒株与药物治疗一致，选择更加适宜治疗的药物，提升药物的使用质量[7]。特别对于一些药物使用不规范的患者，自行停药造成耐药性增加，严重影响疾病恢复进程。

上文中对突变率分析，发现总发生率为70.00%，比例较高，而不同突变形式分析，发现主要突变形式为M2041、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V，发生率分别为16.67%、18.33%、21.67%、13.33%，分析不同基因型突变率，发现B型占据比例最高，为59.52%，其次为C型，19.05%，BC混合型发生率最低，仅为7.14%。根据学者研究，选取98例中共检测到62例(63.27%)发生耐药相关基因突变,存在23种变异形式,最常见模式为M204I、M204V、N236T+M204V、L180M+M204V；17例为多重耐药突变；主要变异位点为M204V、M204I、L180M、N236T。耐药药物的使用与产生的耐药位点基本一致,单用拉米夫定的突变率为70.97%,较单用阿德福韦酯及恩替卡韦高。C基因型组中多基因突变比例75.00%较B基因型组的34.29%高。停药组的突变率为72.97%,明显高于非停药组33.33%，与该文研究结果存在一致性。分析原因：HBV的基因类型存在显著的地域性差异，我国北方主要以C型为主，而南方则主要以B型为主，因此在基因分型方面，存在不同的特征性差异，研究发现[8]HBV基因分型与P区耐药突变模式存在关系，认为C基因型耐药检出率高于B基因，因此可以初步分析HBV基因分型与耐药性、乙肝进程存在联系；在进行耐药性研究发现，因为各种原因治疗依从性较差的患者较多，不规范使用抗病毒药物的情况较为常见，如未能按照治疗规范的需要停药，可能导致疾病的复发，甚至出现肝衰竭，核苷(酸)类似物在使用过程中可以对HBV DNA多聚酶进行抑制，但是仅能抑制乙肝病毒的复制，对于无法对cccDNA进行作用，因此药物治疗过程中不能将乙肝病毒进行清除，但是cccDNA的寿命几乎可以与肝细胞达到一致，一旦其在干细胞核内形成[9]，稳定性较强，无法完全进行清除，仅能依靠抗病毒药物对其复制进行抑制将其耗竭，因此规范化的药物使用较为关键，可以在一定时间内将肝细胞内的cccDNA耗竭，保持治疗质量，如果在未得到e抗原血清学转化标准时而停止使用药物，病毒则会马上因为失去药物的抑制而重新进行复制，导致疾病突然加重，甚至出现肝衰竭，可见不规范使用核苷(酸)类似物后果较为严重[10]；对突变形式以及突变率进行分析，发现LAM具有高耐药基因屏障，其突变主要在逆转录酶基因C区中发生，碱基子在发生转换时产生M2041，如继续维持LAM治疗，则出现耐药性增强突变至L180M，同时出现多种组合耐药性，例如L180M+M204V等[11]。ETV则是一种鸟嘌呤核苷类似物，其耐药点位在L180M+M204V基础上出现A区rtI169T等突变，但是发生率较低，对于初次治疗患者几乎不发生耐药。因此突变类型进行分析需要结合HBV基因型、全基因序列以及患者的各项临床表现进行综合分析，确定增加准确的耐药变异点位，提升疾病治疗质量[12-13]。

综上所述，慢性乙肝患者在进行疾病治疗的过程中因为不规范使用核苷(酸)类似物引发耐药性，因此在疾病治疗早期可进行HBV耐药基因突变测试，更加全面了解患者自身特征，规范使用核苷(酸)类似物抗病毒治疗，提升疾病治疗质量。