太子参内生真菌NSZJ-1抗氧化活性的初步研究

王俊丽，王 龙，欧阳湖，焦松林，任建国

贵州医科大学公共卫生学院 环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳 550025

太子参为中药材的一种，有保护心肌功能、促进免疫、抗应激、治疗糖尿病、止咳等功效。目前在福建、贵州、江苏、安徽等地均有种植生产，但由于连作障碍、化肥和农药等过度施用现象的存在，使得药材品质下降，进而影响到其药用安全问题。鉴于植物内生菌会产生与宿主相同或相似的生理活性成分[1]，且其发酵不受季节环境条件的影响，因而有望代替中药材的种植生产来获得药用活性成分。已有众多关于药用植物内生真菌产生活性成分的研究报道，如从银杏(Ginkgobiloba)叶中分离得到可产生抑菌(Rhizoctoniasolani和Sclerotiniasclerotiorum)物质sporothriolide的内生真菌Nodulisporiumsp.A21[2]；从青藤(Sinomeniumacutum)叶中分离得到具有细胞(Hela,HCT116和A549细胞系)毒性活性成分sinopestalotiollides A-D的内生真菌Pestalotiopsispalmarum[3]；从药用植物Polygalaelongata中分离得到具有抗氧化活性(ABTS和DPPH自由基)的内生真菌Colletotrichumsp.[4]，另外从药用植物Azadirachtaindica中分离得到的5株内生真菌次生代谢物有机提取物活性表明，其具有抑菌、抗氧化和抗糖尿病功能，因而可用于特定药物的生产上[5]。Tanapichatsakul等[6]从越南肉桂(Cinnamomumloureiroi)叶中分离得到能产生丁香油酚的内生真菌Neopestalotiopsissp.和Diaporthesp.，其代谢产物表现出明显的抑菌活性和抗氧化活性。关于太子参内生真菌的研究仅有有限报道[7]，为此，本研究计划从贵州省道地药材太子参中去分离内生真菌，以研究其代谢产物抗氧化活性，为天然活性化合物的获得奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：新鲜太子参(Pseudostellariaheterophylla)块根(来自贵州省施秉县牛大场镇太子参种植基地)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)；福林酚试剂(上海荔达生物科技有限公司)；没食子酸(中国药品生物制品鉴定所)；抗坏血酸(中国药品生物制品鉴定所)；其它化学试剂均为分析纯。

仪器：Multiskan GO酶标仪(赛默飞世尔科技)；FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；GL-21B离心机(上海安亭科学仪器厂)；R-100旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；CLG-32L全自动高压灭菌器(日本ALP)；SW-CJ-1B超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；ZGP-9050P隔水式恒温培养箱(上海喆图科学仪器有限公司)；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于分离、活化真菌，马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)用于菌株发酵。

1.2 实验方法

1.2.1 内生真菌的分离与纯化

把采集来的新鲜无病斑太子参块根样品用自来水清洗干净、风干，然后依次用75%的酒精表面消毒1 min、5%的次氯酸钠溶液消毒5 min，再用无菌水清洗5次，取100 μL的第5次清洗液放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中，进行涂布培养(30 ℃)，以确证表面彻底消毒。

在超净工作台上把经表面消毒的太子参块根切成约1 cm见方的组织块，放入PDA平板中，每个平板等间距放置3个组织块，于30 ℃下恒温培养以分离内生真菌。通过不定期观察，将从块根上已经分离出的菌丝体移接于其它PDA平板上，恒温培养(30 ℃)且观察真菌是否纯化。纯化菌株移接PDA试管培养、低温保存和备用。

1.2.2 内生真菌的致病性测定

将分离得到的内生真菌进行致病性测定：首先对新鲜无病斑太子参块根进行表面消毒(采用实验“1.2.1”中的消毒方法)，然后用解剖刀横切块根约为相等两份，分别置于用无菌水浸润的灭菌滤纸(位于培养皿内)上，在其中的一份块根组织切口处接种内生真菌，另一份不接种作为对照，用封口膜密封培养皿，28 ℃下恒温培养，观察块根切口致病情况。若组织切口有变褐、软化，且菌丝体大量生长，初步判断为该内生真菌为病原真菌。该菌株再经柯赫氏法则验证后，即为病原真菌，否则为内生真菌。

1.2.3 内生真菌的鉴定

致病性内生真菌的初步鉴定依照PDA平板培养特征、产孢结构及孢子的显微观察进行；而非致病性内生真菌的鉴定步骤如下：从PDA平板上挑取少量菌丝体移入已灭菌的盛50 mL 马铃薯葡萄糖培养液(PDB)三角瓶中，28 ℃、120 rpm水浴振荡摇床培养7天，用灭菌玻璃棒挑取菌丝团进行DNA提取。具体提取过程参考真菌DNA提取试剂盒说明书(Qiagen 69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)，德国QIAGEN公司)。采用引物ITS1和ITS4扩增内生真菌菌株的rDNA ITS区，进行PCR 反应。反应条件：93 ℃预变性3 min，94 ℃预变性4 min，95 ℃变性0.5 min，55 ℃复性1.0 min，72 ℃延伸0.5 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得的序列，利用BLAST与GenBank中的已知序列进行比对，寻找相似度最高的菌株，结合形态学特征，确定内生真菌的分类地位。

1.2.4 内生真菌抗氧化活性试验

将内生真菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取6 mm菌碟接种于150 mL马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中培养，29 ℃、180 rpm培养5天，以不接种内生真菌的培养液作为空白对照，重复3次。依照Pan等[8]方法进行石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物制备和6个不同浓度各提取物供试液制备(见表1)。DPPH自由基清除能力测定参考余兰彬等方法[9]；羟自由基(·OH)清除能力测定参考任薇等方法[10]；以1 mmol/L抗坏血酸为阳性对照。

表1 不同极性供试液浓度设置Table 1 Concentration setting of the different polar solutions assayed (mg/mL)

1.2.5 内生真菌抗氧化成分分析

多酚含量测定采用福林酚法[11]。标准曲线绘制：用蒸馏水配制浓度为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL没食子酸溶液，分别取上述溶液1 mL于25 mL试管中，再加1.0 mL福林酚试剂、23.0 mL 5%碳酸钠溶液，混匀后于25 ℃水浴60 min，在745 nm下测定吸光度，绘制标准曲线为y=47.786x+0.104 3(R2=0.972 7)。

样品含量测定：取5 μL样品溶液于EP管，加5 μL福林酚试剂、240 μL 5%碳酸钠溶液，混匀，恒温水浴后在745 nm测定吸光度。每个样品重复三次。总酚含量以每毫升培养液含有相当没食子酸的毫克数表示，即mg/mL。

1.3 数据分析

以上试验数据均重复测定3次，其结果以平均数的形式表示。采用SPSS17.0(IBM公司)统计分析软件。检验水准α=0.05。Excel进行数据整理。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的获得

经纯化分离获得10株内生真菌，PDA平板培养特征见图1。由PDA平板培养特征结合菌丝体生长情况，将内生真菌分为3类：第1类包括菌株GS-1、GS-3、GS-5、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6，菌丝体呈现棉絮状，有紫色色素产生。菌丝体生长速度快，28℃恒温培养5天，菌落直径达9 cm；第2类为GS-7和GS-8，菌丝体致密、平铺呈垫状，有黄黑色色素产生。菌丝体生长速度慢，28 ℃恒温培养7天，菌落直径约5 cm；第3类为菌株NSZJ-1，白色菌丝体致密、平铺于培养基表面，背面有棕褐色色素产生。菌丝体生长速度慢，28 ℃恒温培养7天，菌落直径约3～4 cm之间(图1-1)。由此可见,太子参块根含有丰富的内生真菌资源。

图1 内生真菌在PDA平板上的培养特征Fig.1 The cultural characteristics of endophytic fungi on PDA plate注：1～10：NSZJ-1、GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5、MD-6。

2.2 内生真菌的致病性

室内新鲜太子参块根接种致病情况表明，菌株NSZJ-1为非致病内生真菌(块根组织不呈现软化变褐现象)，而菌株GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6均为致病内生真菌(块根组织呈现软化变褐现象)，其感染致病太子参块根状况见图2。受致病内生真菌感染的块根出现腐烂坏死状，且菌丝体在块根上生长旺盛(图2-4)，而非致病内生真菌接种后的块根则无上述变化(图2-2)。由此可见，外观呈现无感病状态的太子参块根其内部潜伏存在有病原真菌的侵染。

图2 内生真菌对太子参块根致病情况测试Fig.2 Assays on pathogenicity of endophytic fungi on root tuber of Pseudostellaria heterophylla注：1和3为对照；2和4为接种内生真菌。Note:1 and 3 are controls;2 and 4 are inoculated with endophytic fungi.

2.3 内生真菌的鉴定

由试验结果“2.1”得到的第1类内生真菌产孢结构为单瓶梗，有大型镰刀状分生孢子和小型分生孢子，且有紫色素产生，初步确定为镰刀菌类(Fusariumsp.)；第2类内生真菌产孢结构轮枝分支，有球形分生孢子，且有黑色素产生，初步鉴定为轮枝孢菌类(Verticilliumsp.)；第3类内生真菌NSZJ-1产孢结构为单瓶梗或轮枝分支，有大型柱状分生孢子(多为3分隔，平直)和厚垣孢子形成(图3)。ITS序列分析表明其与Cylindrocarponsp.(AB369260.1)、Dactylonectriapauciseptata(LC427841.1)、Cylindrocarponpauciseptata(JF735305.1)和Ilyonectriaradicicola(HM214452.1)有100%同源性(系统进化树自展值为99%，见图4)，结合菌株NSZJ-1在PDA上的培养特征以及大型分生孢子的隔膜数、小型分生孢子和厚垣孢子的有无以及参考文献[12]，将内生菌NSZJ-1鉴定为柱孢属(Cylindrocarponsp.)。

图3 内生菌NSZJ-1菌丝体及孢子形态显微结构(×10)Fig.3 Microscopic structures of mycelia and spores of endophytic fungus NSZJ-1 (×10)

图4 基于 rDNA ITS序列系统进化树的构建(邻接法)Fig.4 The construction of phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence (neighbour joining method)

2.4 内生真菌NSZJ-1的抗氧化活性

内生真菌振荡培养、去除菌体后，不同极性粗提物DPPH自由基清除能力和羟自由基(·OH)清除能力测定结果见图5和6。从图5和6中可看出，在各相粗提物测试浓度范围内，随着浓度的增加，DPPH自由基和羟自由基(·OH)清除率增加。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物清除DPPH自由基、羟自由基(·OH)的IC50值分别为270.537、27.189、2.061、0.672、6.181 mg/mL和946.221、39.957、9.466、1.053和11.270 mg/mL，由此可见，内生真菌抗氧化物质主要集中在乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中，且正丁醇提取物抗氧化性最强，其次为乙酸乙酯提取物。1 mmol/L 抗坏血酸的DPPH自由基和羟自由基(·OH)清除率分别为96%和95.1%。

2.5 内生真菌NSZJ-1抗氧化成分多酚测定

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物总多酚含量用没食子酸当量(mg/mL)来表示，分别为0.000 1、0.002 9、0.005 5、0.018 6、0.011 1 mg/mL。内生真菌NSZJ-1多酚主要集中在正丁醇提取物中，其次为乙醇提取物中，再者为乙酸乙酯提取物，而在二氯甲烷提取物中多酚的含量约为前三者的15%～50%，石油醚提取物中多酚含量几乎为0；二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚含量与DPPH自由基和羟自由基清除率的关系分别见图7和8。

图5 不同极性有机提取物对DPPH清除能力Fig.5 The scavenging capacities of different polar extracts on DPPH radical

图6 不同极性有机提取物对羟自由基清除能力Fig.6 The scavenging capacities of different polar extracts on hydroxyl radical

在一定范围内，多酚对DPPH自由基和羟自由基的清除率随其浓度的增加而增强。二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚清除DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为1.966、0.949、4.138、1.677 μg/mL和3.353、4.415、6.241、2.710 μg/mL。

图7 不同有机提取物中多酚含量与DPPH自由基清除率的关系Fig.7 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and DPPH radical scavenging efficiency注：A：二氯甲烷；B：乙酸乙酯；C：正丁醇；D：乙醇。Note:A:Dichloromethane;B:Ethyl acetate;C:n-Butanol;D:Ethanol.

图8 不同有机提取物中多酚含量与羟自由基清除率的关系Fig.8 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and hydroxyl radical scavenging efficiency

3 讨论

目前已从药用植物中获得具有抗细菌、真菌、病毒、氧化、肿瘤、糖尿病和利什曼病等作用的众多内生真菌，因而有望被用于临床药物开发研究中。本研究从贵州道地药材基地采取太子参分离获得的内生真菌NSZJ-1为柱孢属(Cylindrocarponsp.)明显不同于福建产地太子参分离得到的内生真菌(DPPH自由基清除的IC50值相差很大)[7]，进而说明宿主植物栖息地点对内生真菌的寄主专一性有影响[13]。

对于药用植物内生真菌代谢物抗氧化研究方面，前人已有诸多报道。Septiana等[14]从Curcumalonga叶中分离得到的内生真菌Bo.Ci.Cl.D1和Bo.Ci.Cl.D2，其乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除的IC50值分别为24.04和96.08 mg/mL，多酚含量分别为113.47和81.83 mg/g，该结果表明提取物多酚含量与其清除DPPH自由基能力正相关，同时也间接暗示了这类物质是主要的抗氧化剂。关于药用植物内生真菌抗氧化研究，以往大多研究集中在乙酸乙酯提取物方面[15,16]，且发现内生真菌的抗氧化能力与其代谢物全酚含量正相关[15]。Sorout和Arunachalam[17]从药用植物Azadirachtaindica中分离得到5株内生真菌，不同内生真菌含有的植物化学成分种类各不相同，其中F5菌株代谢物植物化学成分种类最多，对其进行PDB发酵培养、有机溶剂提取得到的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取物进行全酚测定及抗氧化(DPPH自由基清除)试验，结果表明：多酚含量为乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物；抗氧化活性为乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物。本研究采用与文献[17]相同的培养基质进行内生真菌发酵培养，获得了与其相似的抗氧化活性结果，具体表现在各提取物的IC50值上。Xue等[18]对内生真菌代谢物的抗氧化性(DPPH自由基和羟自由基)研究表明，3个内生真菌发酵液乙酸乙酯提取物有较强的DPPH自由基清除能力，但对羟自由基的清除能力却很弱，本研究结果表明内生真菌NSZJ-1的正丁醇提取物有明显的DPPH自由基、羟自由基清除能力，但进一步试验表明乙酸乙酯提取物中多酚具有较强的DPPH自由基清除能力，乙醇提取物中的多酚具有较强的羟自由基清除能力，造成有机溶剂粗提物与多酚类物质对自由基清除结果不一致的原因可能是内生真菌还可能产生多酚类之外的其它类抗氧化物质。

目前除了本研究从太子参块根中分离得到柱孢属(Cylindrocarponsp.)内生真菌外，也有文献报道从药用植物Parispolyphyllavar.yunnanensis[19]、Sapiumellipticum[20]和Saussureainvolucrate[21]等中分离得到此属内生真菌，且相关文献报道此属内生真菌能够产生一些新结构化合物[20]，为此今后有必要对太子参内生真菌NSZJ-1代谢物进行单体分离、纯化、结构鉴定及其生物活性开展研究，为天然药物开发利用奠定基础。