基于网络药理学的枳术丸治疗慢传输型便秘的潜在分子机制

武鹏飞，庞雪，辛学知

1 山东中医药大学，济南250014；2 山东第一医科大学第一附属医院

慢传输型便秘(STC)是因为结肠动力障碍，肠内容物通过结肠过慢或停滞所引发的便秘。临床中西医对于STC的治疗常采用促分泌剂、促动力剂、手术等手段，但不良反应较大，甚至加重便秘。枳术丸出自李东垣的《内外伤辨惑论》，全方仅枳实、白术两味药，但配伍巧妙。现代药理学研究表明，白术中主要活性成分为内酯类，具有促进胃肠蠕动和吸收的作用；枳实中主要活性成分为生物碱和黄酮类，具有改善胃和小肠排空、抗炎、抗菌、抗氧化的作用。但是，该药在细胞与分子层面的机制尚未阐明。2020年3～5月，我们以网络药理学为依托，结合分子靶点与疾病之间的相互作用，探索枳术丸治疗STC的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 枳术丸主要化学成分及其作用靶点筛选 依托中药系统药理学(TCMSP)数据库[1](http://tcmspw.com/tcmsp.php)，输入组成枳术丸的两味中药名枳实、白术，搜索得到各自的化学成分；以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为指标对化合物进行筛选，得到符合条件的化合物；再次通过查询该平台，得到与化合物对应的蛋白质靶点。此外，通过查阅已发表的文献，补充因筛选指标而被舍弃的重要化合物的靶点。为得到标准化的蛋白质靶点信息，将得到的靶点上传至Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)进行规范。

1.2 药物分子-靶点网络构建及STC致病相关靶点筛选 将上述枳术丸中各药物的化合物及蛋白质靶点上传Cytoscape3.7.2软件，进行枳术丸化合物—靶点网络的构建。通过Gene Cards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(https://omim.org)，以“Slow transit constipation”为关键词，挖掘STC的疾病潜在靶点，通过Drugbank数据库[2](https://www. drugbank.ca)搜索治疗STC的一线西药靶点作为补充。根据经验筛选大于“Relevance score”中位数的靶点作为STC的潜在靶点，若靶点过多，则再次筛选；将上述结果与OMIM数据库搜索得到的结果整合，删除重复值，得到STC的潜在致病靶点。

1.3 药物靶点与疾病靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建 为进一步明晰枳术丸药物相关靶点与STC疾病靶点之间的作用，将二者靶点取交集，在R语言软件上绘制韦恩图；将二者交集靶点上传至String11.0平台[3](https://string-db.org)，最小相互作用阈值“highest confidence”选择>0.9，其余设置均为默认值，得到PPI网络。

1.4 PPI网络拓扑分析与核心靶点筛选 选择Cytoscape3.7.2软件中的BisoGenet插件，点击“Tools-Network Analyzer-Network Analysis-Analyze Network”，对PPI网络进行功能分析；然后利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，在Centralities中勾选除“degree”之外的全部选项，点击“analyze”进行分析，并将结果以.csv格式导出，以便使用Excel打开查看。根据经验，若靶点过多则使用关键属性值的2倍中位数作为核心靶点筛选条件的最小值，第一次筛选条件设定为degree>50，第二次筛选条件设定为degree>166、betweenness>1 578.81。

1.5 核心靶点的GO富集分析与KEGG通路分析 利用Bioconductor生物信息软件包(http:// www.bioconductor.org)，使用R语言软件，以P≤0.05对核心靶点进行GO富集分析与KEGG通路分析，并选取P值排名前20的结果。

1.6 STC致病靶点-信号通路网络构建 通过Cytoscape3.7.2软件构建STC致病靶点-信号通路网络图，进一步明确靶点与信号通路在枳术丸治疗STC中的作用。

2 结果

2.1 枳术丸活性成分及其靶点 通过TCMSP数据库初步提取枳实化学成分65种、白术化学成分55种，经过ADME筛选后获得枳实18种、白术4种(表1)。再将上述化学成分输入TCMSP数据库，搜索与之相对应的成分作用靶点，经筛选后获得枳实266、白术22个，合并以后删除重复值共得到成分作用靶点126个。

2.2 药物分子-靶点网络构建结果 从药物分子-靶点网络中共得到149个节点，309条边。其中枳术丸治疗STC的核心活性成分为木犀草素、柚皮素、川陈皮素等。

表1 枳术丸主要活性成分

2.3 STC致病相关靶点获取结果 搜索关键词得到靶点3 278个，经筛选、整合、删重最终得到861个STC潜在致病靶点。

2.4 枳术丸药物靶点与STC致病靶点PPI网络构建结果 将枳术丸药物靶点与STC致病靶点取交集，得到共同靶点67个；将得到交集靶点PPI网络，得到枳术丸治疗STC的核心靶点有MAPK3、MAPK1、AKT1、IL6、TP53、JUN等。

2.5 PPI网络拓扑分析结果 根据“1.4”之中的筛选条件，得到一个7 768个节点、176 055条边的PPI网络图；以degree值的2倍中位数进行一次筛选后，得到一个2 091个节点、86 910条边的PPI网络图；再以degree值、betweenness值的2倍中位数进行筛选后，得到一个192个节点、6 579条边的PPI网络图。

2.6 核心靶点的GO 富集分析与 KEGG 通路分析结果

2.6.1 GO富集分析结果 共得出生物学过程(BP)1 890个、分子功能(MF)51个、细胞组成(CC)83个；BP涉及细胞对氧化应激的反应、对活性氧的反应、对辐射的反应、对紫外线(UV)的反应，CC涉及细胞周期素—依赖性蛋白激酶全酶复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白激酶复合物、膜筏、膜微域等，MF涉及磷酸酶结合、泛素-样蛋白连接酶结合、蛋白磷酸酶结合、泛素蛋白连接酶结合、BH结构域绑定等。

2.6.2 KEGG 通路分析结果 共得出162条通路，其共同靶点在前列腺癌、内分泌抗性、乙型肝炎、卡波西肉瘤-相关疱疹病毒感染等疾病和IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路等上富集较多。

2.7 STC致病靶点-信号通路网络构建结果 通过STC致病靶点-信号通路网络进一步明确，枳术丸治疗STC核心靶点主要有AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TP53等。

3 讨论

中药复方治疗STC自古就有良好的效果，其治疗效果优于临床一线西药。刘芳等[4]研究发现，对于STC热秘证患者，服用枳实导滞丸加减比服用枸橼酸莫沙比利分散片联合麻仁丸效果更优，且复发率更低。王浩[5]通过随机对照试验表明，使用枳术丸可以改善老年STC患者的便秘症状和生活质量。动物实验发现，生白术可以通过提高大鼠结肠组织c-Kit mRNA表达，修复结肠Cajal间质细胞，恢复结肠平滑肌的收缩性，促进蠕动[6]；另外，枳实挥发油中的D-柠檬烯可通过调节肠道菌群达到治疗STC的效果[7]。研究还发现，枳术丸可通过提高小鼠结肠组织中PLC-γ1与PLC-γ2蛋白和mRNA表达，有效促进其胃肠道运动，改善便秘症状[8]。

本研究通过网络筛选结果显示，枳术丸中主要活性成分为木犀草素、柚皮素、川陈皮素、异橙黄酮、3β-白术乙酰基等。研究表明，木犀草素可通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，从而减少一氧化氮(NO)产生[9]。NO可进入胃肠道平滑肌细胞，抑制结肠平滑肌收缩，使结肠运动变得缓慢，导致STC发生[10]。肠道微生物紊乱被认为是功能性胃肠道疾病的重要病理生理学基础，而柚皮素对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有良好的抑菌作用[11]。川陈皮素可双向调节小肠平滑肌的收缩性，动物实验中，可显著提高小肠组织中的肌球蛋白磷酸化，上调肌球蛋白轻链激酶 mRNA和蛋白表达[12]。

本研究结果表明，枳术丸治疗STC的靶点主要集中在AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TP53。MAPK是由多个蛋白质组成的一个复杂通路，对于细胞的增殖、分化和凋亡过程发挥着重要调节作用[13]。MAPK对水通道蛋白(AQPs)在细胞中的表达有着调节作用，而AQPs主要分布于参与水分吸收和传输的组织当中，起着促进调节水分运输的作用[14]。马雪巍等[15]发现，AQP3在便秘大鼠结肠近端组织的表达较正常大鼠明显提高，并且抑制AQP3表达可减少结肠对于水分的吸收。AKT1、RELA、TP53可能对肠道动力学发挥作用，但目前研究较少，机制不明确。

GO分析发现，枳术丸调治STC的BP主要富集在细胞对氧化应激的反应、对活性氧的反应、对辐射的反应、对UV的反应等。KEGG分析结果显示，枳术丸治疗STC的主要通路为IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路。研究表明，PI3K/AKT信号转导通路可以调节炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的产生和释放；而TNF-α可诱导NO产生，影响微循环及胃肠道平滑肌的运动[16]。IL-17信号通路及相关的IL-17家族(IL-17A～F)参与炎症、自身免疫、感染等方面的调控。研究表明，IL-17A可诱导iNOS和环氧合酶2(COX-2)的表达[17]。有实验发现，当结肠不完全机械性肠梗阻大鼠梗阻近端扩张的平滑肌细胞收缩能力明显下降时，其COX-2 mRNA和蛋白表达均明显上升；COX-2基因缺陷小鼠结肠运动功能受影响程度较小，抑制COX-2表达可恢复平滑肌的收缩功能[18]。

本研究表明，枳术丸通过多种成分、多个靶点、多条通路发挥治疗作用。但是，由于网络药理学其本身的局限性和中药成分、疾病靶点数据库信息收集不全面，以及不同药物在体内相互作用机制不明确等因素，本研究结果将进行后续临床观察进一步验证。