基于化学模式识别技术的枳实HPLC定量指纹图谱研究

戚华文，徐 鑫，温 柔，高德嵩，王超然， 刘艳芳，金红利，梁鑫淼

(中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023)

枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck 的干燥幼果，具有破气消积，化痰散痞的功效，常用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸、脏器下垂等症状[1]。枳实中含有黄酮苷类成分，主要为柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷等[2-4]。现在药理学研究表明，枳实具有促进肠胃蠕动、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等药理活性[5-7]。枳实药材资源分布广泛，主产于江西、湖南、四川等地，以江枳实(江西清江)、湘枳实(湖南沅江)等为道地药材，并根据直径进行枳实等级划分，均以肉厚瓤小、质坚实、香气浓者为佳。由于枳实产地广泛且栽培品种繁多，市场上药材质量差异较大[8]，药典中枳实仅以辛弗林为含量测定及鉴别对象，并不能完全反映药材的品质，因此建立一种简单有效的分析方法对不同产地枳实进行质量评价显得尤为重要。

指纹图谱是鉴定中药真伪、评价其质量一致性和稳定性的可行性方法，通过光谱和色谱法获得中药的化学成分，具有信息量大、特征明显、完整性和模糊性等特点[9-10]。中药指纹图谱可以反映出各种化学成分分布的整体状态,从而更全面地对中药进行质量评价。本文采用高效液相色谱(HPLC)法对22批枳实药材的指纹图谱进行研究，并利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS)联用技术鉴定共有峰的化学结构，同时结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等化学计量学方法对其质量稳定性进行研究，并探讨枳实HPLC指纹图谱共有模式在易混淆品枳壳中的鉴别应用，为枳实质量评价提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

表1 药材样品信息Table 1 Sample information of medicinal materials

高效液相色谱系统，包括2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站(美国沃特世公司)；MS204TS电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；超高效液相色谱系统(日本岛津公司)，AB SCIEX X500系列QTOF质谱仪(美国AB SCIEX 公司)。Tnature-ACCHROM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国沃特世公司)、Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国沃特世公司)、Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,美国安捷伦公司)。

新橙皮苷(批号B21390，规格20 mg，纯度98.0%)购自上海源叶生物科技有限公司。药材：枳实药材S1～S22共22批，采自江西刘公庙、湖南、福建等地；枳壳药材Z1～Z5共5批，采自江西刘公庙，各批次药材质量符合2020年版《中国药典》，经中国科学院大连化学物理研究所杨小平鉴定，均为正品，具体信息见表1。乙腈、甲醇(4 L，色谱级，Sigma-Aldrich)；甲酸(500 mL，色谱级,Aladdin)。实验室用水来自Milli-Q超纯水净化系统(Billerica,MA,USA)。

1.2 实验条件

1.2.1 HPLC-DAD色谱条件色谱柱：Tnature-ACCHROM C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.5%甲酸溶液(B)，程序洗脱：0～10 min,5%～18%A；10～35 min,18%～27%A；35～40 min,27%～48%A；40～60 min,48%～95%A；60～65 min,95%A；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；检测波长为320 nm。

1.2.2 HPLC-QTOF-MS质谱条件液相条件与上述相同。离子源：ESI 离子源；正离子模式；气帘气：241.3 kPa；Gas 1：379.2 kPa；Gas 2：379.2 kPa；温度：550 ℃；离子化压力：5 500 V，去簇电压：80 V；全扫描范围：m/z50～1 500；裂解电压：40 V;CE Spread：20 V。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的制备取新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含新橙皮苷80 μg的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备取枳实药材粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率500 W，频率40 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，连续进样6次，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。

2.1.2 稳定性取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，分别于0、6、12、18、24 h注入液相色谱仪，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD小于5%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.1.3 重复性取批号为S1的枳实药材，制备6份供试品溶液，进样，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积的RSD小于5%，表明该方法的重复性良好。

2.2 耐用性试验

2.2.1 色谱柱的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，在相同色谱条件下，考察了规格均为250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm的Symmetry C18、Eclipse XDB-C18和Tnature C183根C18色谱柱对枳实特征图谱的影响。结果显示，在3根C18色谱柱上，枳实特征图谱的色谱峰数目和分离度均无明显差异。实验最终选用Tnature C18色谱柱。

2.2.2 柱温的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，考察20、25、30、35、40 ℃等不同柱温对枳实特征图谱的影响。结果显示，5种柱温条件下特征图谱的分离效果无明显差异，各色谱峰的峰形和分离度均较好。表明不同柱温对枳实药材特征图谱的影响较小，最终选择柱温为30 ℃。

2.2.3 不同流速的影响取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，考察了0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min等不同流速对枳实特征图谱的影响。结果显示，不同流速条件下，枳实特征图谱的分离效果差异不大，实验最终选择流速为1.0 mL/min。

2.3 枳实指纹图谱的建立

取22批(S1～S22)枳实药材，按“1.3.2”制备枳实供试品溶液,按“1.2.1”依次进样检测，采集22批枳实的HPLC指纹图谱(图1)。将S1～S22批枳实样品的色谱图全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》(2012版)，以S1批药材的图谱为校正参照，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，可识别12个共有色谱峰，得到枳实药材的对照谱图(图2A)，选择出峰时间稳定且相对居中的新橙皮苷峰作为参比峰。根据色谱峰匹配结果进行相似度分析，得S1～S22指纹图谱与共有模式对照指纹图谱的相似度分别为1.000、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.998、0.998、0.999、0.998、0.962、0.937、0.955、0.965、0.946、0.950、0.930、0.922、0.973、0.954。相似度结果显示，22批枳实药材的相似度均在0.9以上，无法区分不同产区的枳实药材。

2.4 指纹图谱共有峰的指认

为明确枳实的物质基础组成，本实验采用HPLC-QTOF-MS对枳实中的化学成分进行较全面的定性分析，从而提高其质量控制水平。取批号为S1的枳实药材，制备供试品溶液，按“1.2.2”的HPLC-QTOF-MS质谱条件进行质谱数据采集，通过比对精确相对分子质量和特征碎片离子，结合软件推断的分子式及文献报道，鉴定出枳实11个共有峰，结果见表2。

2.5 聚类分析(CA)

以22批枳实指纹图谱中12个共有峰峰面积为变量，导入SPSS 22.0软件，采用组间均连法，选择平方欧式距离为测度对其进行系统聚类分析。根据CA结果(图3)，22批枳实样品分为2类，其中来自江西产区的样品S1～S12聚为一类，来自福建和湖南产区的样品S13～S22聚为一类，表明福建与湖南产区的枳实指纹图谱相似度较高。对3省产区的枳实性状进行比较，结果表明，江西的枳实皮较厚、瓤囊较小，而湖南和福建两个产区的枳实性状相近，但与江西产区枳实的性状差异显著。因此，聚类分析结果与性状鉴别结果一致。

图1 22批枳实药材的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 22 batches of Citrus aurantium

表2 枳实特征峰的鉴定Table 2 Identification of characteristic peaks of Citrus aurantium

图3 22批枳实药材的聚类分析树状图
Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 22 batches ofCitrusaurantium

图4 枳实药材样品的PCA分析得分图Fig.4 PCA scores of Citrus aurantium samples

图5 枳实药材样品的OPLS-DA分析得分图Fig.5 OPLS-DA scores of Citrus aurantium samples

图6 枳实样品的变量载荷评价参数(VIP)值Fig.6 Variable load evaluation parameter(VIP) value of Citrus aurantium samples

2.6 主成分分析(PCA)

PCA是采用线性投影将原来的多个变量空间转化成一组新的正交变量的统计分析方法，可实现高维数据的降维处理，少数几个主成分即可代表原始数据的大部分信息[11]。本实验采用SIMICA 14.1软件，以22批次枳实样品的共有峰峰面积为数据阵，对不同产区枳实药材进行主成分分析。根据得分图(图4)可以看出，江西产区枳实聚为一类，福建和湖南产区聚为一类，不同产区的枳实样品存在差异性，与聚类分析结果一致。由图4还可以看出，产区为湖南的样品S23离散度较大，说明同一产区样品的内部差异性较大；而江西产区样品分布较为集中，差异性较小。

2.7 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

为了更好地观察样品组间差异，采用有监督的OPLS-DA模型对22批枳实进行分析[12]，得分图见图5。由模型验证参数可知，数据矩阵的结实率参数R2X=0.893，模型区分参数R2Y=0.99，模型预测参数Q2=0.973，表明建立的模型稳定且有较强的预测能力。从图5中可以看出，江西产区与其他产区(福建与湖南)的枳实在OPLS-DA 图中呈现了各自的特定区域，分离效果明显。

为进一步确认对样品分类贡献度较大的成分，采用变量载荷评价参数值(VIP)进行评价，该值可以体现变量对模型的整体贡献水平。VIP 值越大，表明变量的贡献程度越大，一般认为，VIP值大于1的化合物在两组分类中发挥了重要作用[13]。本实验筛选出对模型上2组间分类贡献较大的3个变量(图6)，影响大小依次为峰5(橙皮苷)、峰6(新橙皮苷)、峰4(柚皮苷)，说明可能是区分江西枳实与其他两个产区(福建与湖南)枳实的质量差异性物质。

2.8 指纹图谱的鉴别应用

枳实与枳壳均来源于芸香科植物酸橙，其中枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck.的干燥幼果；枳壳为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，二者为同种药材的不同时期，性状比较相近，而功效和主治症方面却有很多不同[14]。本实验取5批枳壳药材(Z1～Z5)，按“1.3.2”制备枳壳供试品溶液,“1.2.1”进样检测，采集5批枳壳的HPLC指纹图谱(图2B)，并与枳实的HPLC指纹图谱(图2A)进行比较。结果显示，枳壳与枳实指纹图谱在成分比例上存在较大差异，经过中药指纹图谱相似度软件处理两个品种相似度为0.68，该方法所建立的指纹图谱可用于二者的鉴别。

2.9 枳实含量的测定

表3 3个指标成分的线性关系及线性方程Table 3 Linear relationships and linear ranges of three components

2.9.1 线性关系精密吸取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品储备液适量，配制成7个质量浓度系列的混合对照品溶液，按“1.2.1”色谱条件进行测定，以各对照品的质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程、相关系数(r2)和线性范围(见表3)。各化合物在一定质量浓度范围内的线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.999。

2.9.2 精密度、稳定性与重复性取同一批次枳实样品粉末(批号S1)，按“1.3.2”方法制备，稀释10倍后按照“1.2.1”色谱条件进行测定，连续进样6针，计算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均质量分数分别为6.83%、2.72%、18.19%，RSD分别为0.54%、0.4%、0.4%。表明仪器精密度良好。

取同一批次枳实样品粉末(批号S1)，经上述样品前处理后，稀释10倍后分别于0、6、12、18、24 h进行测定，计算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均质量分数分别为6.85%、2.74%、18.26%，RSD 分别为0.6%、1.3%、0.6%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取同一枳实样品粉末6 份(批号S1)，经上述样品前处理后，稀释10倍后进行测定，计算得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均质量分数分别为6.73%、2.66%、17.92%，RSD 分别为0.8%、1.7%、1.1%。表明方法重复性良好。

2.9.3 回收率试验精密称取枳实粉末6 份(批号S1)，每份约0.05 g，置于100 mL容量瓶中，分别加入柚皮苷3.78 mg、橙皮苷1.67 mg、新橙皮苷9.84 mg，精密加入甲醇，定容至100 mL，后续处理同“1.3.2”。按照“1.2.1”色谱条件测定，结果显示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为100%、92.5%、101%，RSD分别为1.3%、2.6%、1.1%。

2.9.4 含量测定通过对22 批枳实药材进行分析，测定枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，测定结果见表4。结果显示，江西产区枳实的指标成分含量范围为：柚皮苷6.51%～8.35%、橙皮苷2.23%～4.15%、新橙皮苷16.92%～18.91%；湖南产区枳实：柚皮苷5.54%～5.87%、橙皮苷7.84%～9.81%、新橙皮苷14.22%～16.52%；福建产区枳实：柚皮苷4.81%～5.91%、橙皮苷7.23%～9.73%、新橙皮苷13.27%～15.71%。其中，湖南和福建产区的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量接近，但二者与江西产区存在一定差异。

表4 枳实中3种组分的定量分析Table 4 The quantitative result 3 of three components in Citrus aurantium (%)

(续表4)

3 结 论

本文对22批不同产区枳实药材进行了研究，建立了枳实药材的定量指纹图谱，标定了12个共有峰，并通过HPLC-QTOF-MS指认出11个成分。采用中药指纹图谱相似度软件对22批枳实样品的指纹图谱进行评价，相似度均大于0.9，但无法确定不同产地差异性。因此，在指纹图谱的基础上，通过CA、 PCA 和 OPLS-DA对3个产区枳实药材进行了区分。结果显示，3种化学计量学结果较为一致：江西产区枳实药材聚为一类，福建和湖南产区枳实聚为一类；进一步采用VIP值法进行分析，筛选出橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷为差异性质量标志物。此外，采用同一分析方法对5批易混淆品枳壳进行分析，其指纹图谱与枳实差异较大，可用于二者的鉴别。本文建立的枳实HPLC指纹图谱，方法简单、可靠，可较为全面的反应枳实化学信息，结合CA、 PCA 和 OPLS-DA对指纹图谱进行综合评价，使结果更为全面科学，可用于枳实药材的质量控制。