高压氧治疗对大鼠肾移植后缺血再灌注肾组织中RIP-1、RIP-3表达水平的影响

李浩，杜江，陈安健，杜洋，梁天才，付梓峰，谢智慧，梁国标

遵义医科大学附属医院，贵州遵义563000

缺血再灌注损伤(IRI)被认为是影响肾移植效果的重要因素。IRI的发生受许多因素影响，如Ca2+超载、炎症细胞浸润、免疫系统激活、基因转录重新编程、血管内皮损伤等[1]。缺血的肾脏经再灌注后会进一步加重缺氧和炎症程度[2]。Degterev等[3]研究发现，一种具有坏死形态学特征并受多种因子作用影响的细胞主动死亡过程，能按照固定的信号转导通路和执行程序发生，并将这种现象称为坏死性凋亡。受体相互作用蛋白激酶(RIP)1和RIP-3是坏死性凋亡主要通路的关键信号分子，可启动和调控坏死性凋亡的发生发展[4]。研究显示，坏死性凋亡在IRI中可发挥比凋亡更为重要的作用，这为防治肾脏IRI提供了新的探索方向[5,6]。高压氧(HBO)治疗方法是将患者置身于高于标准大气压的环境里呼吸100%的氧气，其主要用于治疗减压综合征、急性CO中毒、气性坏疽、糖尿病足等疾病[7]。本课题组既往研究发现，移植肾缺血再灌注后，HBO治疗可通过减轻组织炎症反应，降低肾IRI对肾功能的损害；还可能通过增强自噬作用，减轻肾IRI，发挥肾脏保护作用[8]。但HBO对移植肾组织坏死性凋亡影响的相关研究较少。2016年9月～2018年3月，本研究拟通过肾移植技术，建立大鼠肾IRI模型，观察HBO治疗对肾组织RIP-1、RIP-3表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要实验材料 健康6～8周龄SPF级雄性SD大鼠90只，体质量180～220 g，购于第三军医大学实验动物中心。大鼠于温度16～26 ℃、相对湿度45%～70%环境中分笼饲养2周。RIP-1蛋白抗体购于美国Proteintech Group公司，RIP-3蛋白抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，抗体稀释液、山羊血清、多聚体抗兔IgG-HRP、苏木素染液、PBS缓冲液、枸橼酸缓冲液购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 肾移植IRI模型制作及分组处理 90只大鼠随机分为肾移植组、HBO治疗组各36只，假手术组18只。肾移植组、HBO治疗组参考Bao等[8]方法建立左肾移植IRI模型。建模成功标准：供体大鼠左侧肾脏在体灌注后，肾脏颜色苍白，恢复血液再灌注后移植肾动脉恢复搏动，苍白的肾脏逐渐变红润，观察5～10 min见输尿管有尿液流出。假手术组不进行肾移植操作，行右肾切除术后关闭腹腔。HBO治疗组分别于肾移植术后0、2、4 h置于动物实验高压氧舱内，纯氧洗舱5 min后加压至0.02 MPa，5 min后再加压至0.1 MPa，稳压吸氧40 min后减压10 min，共计1 h，保持舱内氧浓度在95%以上。肾移植组及HBO治疗组大鼠分别于再灌注后1、3、5 h经腹腔注射麻醉后切取移植肾，假手术组于相应时点切取左肾，并处死大鼠(各时点6只)。取肾脏部分皮髓质，用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋切片(5 μm厚)，以备HE染色和免疫组化检测。

1.3 肾组织病理观察 采用HE染色，显微镜下观察各组肾组织病理变化。

1.4 肾组织中RIP-1、RIP-3蛋白检测 采用免疫组化法检测各组肾组织中的RIP-1、RIP-3蛋白。步骤如下：制备5 μm厚石蜡切片并脱蜡至水；PBS冲洗后将切片置入3% H2O2灭活内源性过氧化物酶；将切片完全浸泡在盛有EDTA抗原修复液的修复盒中，微波抗原修复，室温下自然冷却后滴加正常山羊血清封闭液；滴加一抗(RIP-1 1∶100、RIP-3 1∶100)，阴性对照滴加PBS代替一抗，置入湿盒中4 ℃冰箱过夜；温箱复温后滴加多聚体抗兔IgG-HRP(二抗)，37 ℃温箱孵育；镜下DAB显色后苏木素染色；1%盐酸乙醇中分化3 s并冲洗10 min；脱水，透明，封片，镜下观察结果。以肾脏组织中出现黄色或棕黄色颗粒为RIP-1、RIP-3阳性表达。显微镜高倍视野下(400×)每张切片随机采集5个视野，Leica Qwin图像处理系统采集图像，用Image Pro Plus6.0图像分析软件测量积分光密度(IOD)值，作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组肾组织病理变化 假手术组各时间点肾组织结构基本正常。肾移植组肾小管管腔扩张，肾小球体积增大，上皮细胞明显肿胀，部分组织呈现颗粒样变性，并出现蛋白样管型及中性粒细胞浸润，随着时间延长而损伤加重。HBO治疗组有不同程度肾小管管腔扩张、肾小球体积增大及上皮细胞肿胀变形，有少量中性粒细胞浸润和颗粒样变性，组织损伤较肾移植组减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理变化(HE染色，400×)

2.2 各组肾组织RIP-1、RIP-3蛋白表达比较 HBO治疗组、肾移植组再灌注后1、3、5 h肾组织中RIP-1、RIP-3蛋白表达均逐渐升高，组内不同时点相比，P均<0.05。HBO治疗组、肾移植组再灌注后1、3、5 h肾组织中RIP-1、RIP-3蛋白表达均高于假手术组，且HBO治疗组相同时点肾组织中RIP-1、RIP-3蛋白表达低于肾移植组(P均<0.05)。详见表1、2。

表1 各组肾组织RIP-1蛋白表达比较

表2 各组肾组织RIP-3蛋白表达比较

3 讨论

IRI指在各种原因导致缺血基础上，组织器官恢复血流再灌注后，细胞出现代谢障碍并使其功能和结构破坏，损伤程度反而加重的现象。缺血导致氧供降低，引起严重的缺氧与微血管功能障碍。而再灌注后可进一步触发激活免疫反应以及程序性细胞死亡等损伤机制，加重组织器官功能损害[9]。对于肾移植患者，肾IRI是影响早期肾功能恢复和患者长期存活的主要因素之一[10]。

坏死性凋亡是细胞死亡形式的特殊类型，是呈现坏死形态学特征并受多种信号转导因子作用影响的细胞主动死亡过程。研究发现，坏死性凋亡一般发生于病毒感染和细菌感染，同时也发生在神经退行性疾病、炎症及器官IRI中[11]。坏死性凋亡是一种由死亡受体及配体启动，依赖RIP介导活化非Caspase依赖的可调控程序性坏死。RIP属于丝氨酸/酪氨酸激酶家族，是参与细胞凋亡、坏死的重要信号转导分子。RIP共有7个家族成员，其中RIP-1、RIP-3在启动和调控坏死性凋亡中发挥关键作用。有研究表明，RIP-3是细胞发生坏死性凋亡所必需的蛋白激酶[12]。

坏死性凋亡的主要通路如下：当Caspase受到抑制时，RIP-1在TNF-α或Fas刺激诱导下被激活，并与RIP-3在磷酸化等作用下形成necrosome信号复合体，进一步激活RIP-3使混合系激酶结构蛋白(MLKL)磷酸化，打开下游通路，MLKL被激活后由单体状态转化为寡聚体状态，从细胞质转移到细胞膜，并形成通透性孔道，破坏细胞膜的完整性，最终导致细胞坏死。RIP-1和RIP-3形成necrosome复合体是发生坏死性凋亡的特异性标志[13]。当细胞在病理状态下不能产生足够的ATP以维系Caspase功能时，依赖Caspase作用的细胞凋亡通路出现障碍，很容易导致细胞发生不依赖Caspase的坏死性凋亡[14]。因此，坏死性凋亡参与许多疾病的病理过程和器质性损伤，尤其是在IRI、急性炎症、病毒感染中发挥着重要作用[15]。

HBO的治疗机制被认为与升高氧分压有关，一定剂量的HBO可使机体抗氧化能力加强，可以清除过多氧自由基，从而保护组织细胞免受自由基的氧化损伤，这是HBO治疗许多疾病的重要分子基础[16]。HBO还可以通过调节细胞内外水、电解质平衡，调节缺血部位微血管舒缩，改善微循环血流动力学，减轻局部水肿等作用，提高组织液和血液的氧含量、氧张力并增强能量代谢和有氧氧化，进而改善局部缺氧情况[17]。另外，HBO还可提高Na+-K+-ATP酶活性，降低细胞内Ca2+浓度，使细胞膜功能恢复正常，这些作用有利于减轻肾IRI、保护肾功能[18]。既往研究发现，低氧诱导因子1α(HIF-1α)参与了肾IRI的病理生理过程，HBO可通过上调HIF-1α mRNA的表达，发挥保护肾功能的作用[19]。我们还发现，IRI可能通过诱导TNF-α和氧自由基的大量产生，加重肾组织细胞凋亡，进一步加重肾功能损害；而HBO干预可能通过抑制TNF-α和丙二醛的产生，减轻组织脂质过氧化，进而减少细胞凋亡，发挥肾保护效应。

本研究前期工作发现，再灌注后肾功能受到明显损害，HBO能明显减轻肾IRI，保护肾功能，其机制主要包括减轻组织炎症反应和增强自噬作用等[8]。研究还发现，HBO治疗可通过抑制ICAM-1和VCAM-1过表达、C3补体活化、ED1浸润和Th17细胞的聚集发挥肾保护作用[20]。我们在前期工作的基础上，初步探讨了坏死性凋亡关键因子在IRI肾组织中的表达变化以及HBO对其表达的影响。本研究结果显示，在肾移植后RIP-1、RIP-3的表达随再灌注时间延长而显著增高，HBO治疗后其表达水平则显著降低，并随时间延长越来越明显。这表明，再灌注早期即可发生RIP-1、RIP-3的表达增高，激活坏死性凋亡相关通路，进而加重肾脏损害。HBO治疗有助于减少RIP-1、RIP-3的表达，抑制坏死性凋亡的发生，从而减轻肾IRI，实现保护肾脏的目的。通过HE染色也观察到，HBO治疗后移植肾组织的病理改变也得到明显改善。

综上所述，IRI能显著诱导RIP-1、RIP-3在肾组织中的表达，而HBO治疗能明显抑制二者的表达，这是HBO在肾IRI中发挥肾保护作用的又一重要机制。但坏死性凋亡在肾IRI发生中的作用机制以及HBO对坏死性凋亡调控的机制还需进一步深入研究。